Atoh7调控视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化的机制研究

【摘要】第一章视网膜Muller细胞的纯化培养及去分化诱导目的：分离和纯化培养视网膜Miiller细胞及去分化诱导并鉴定。方法：取出生10-21天SD大鼠,显微镜下分离视网膜,采用反复不完全胰酶消化法传代培养。取第三代视网膜Muller细胞行荧光激活流式细胞分选仪(FACS)、免疫荧光细胞化学染色及RT-PCR检测,确定视网膜Muller细胞的纯度。取第三代视网膜Muller细胞,在去分化培养基(含1xN2,2xB27,20ng/mlEGF,lOng/mlbFGF)中培养,诱导去分化。显微镜下观察细胞的增殖状态,免疫荧光细胞化学、RT-PCR、Western-blot检测视网膜干细胞特异性标记物Ki-67和Nestin的表达；Edu染色检测细胞增殖能力。结果：FACS检测视网膜Muller细胞的纯度高达98.01%。荧光显微镜10倍下选取10个非重叠视野,计算表达GS的细胞阳性率,GS的细胞阳性表达率为98.50%±1.08%。RT-PCR结果显示纯化后的细胞高表达视网膜Muller细胞特异性标记物(GS、Vimentin),而视网膜中其他类型细胞的标记物无表达。去分化培养3-7天,细胞增殖聚集成球。免疫荧光细胞化学显示,神经球Nestin的阳性率为92.94%±6.48%,Ki-67的阳性率85.96%±6.04%;RT-PCR及Western-blot显示,神经球高表达Ki-67和Nestin的mRNA及蛋白产物。Edu染色显示神经球内细胞核阳性率为82.80±6.65%,表明细胞具有活跃的增殖能力。结论：采用反复不完全胰酶消化传代法可快速、高效获得高纯度的鼠视网膜Muller细胞。纯化的视网膜Muller细胞在去分化培养培养基中克隆增殖形成神经球,表明Muller细胞是一种潜在的视网膜干细胞来源。第二章Atoh7体外调控视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞的定向分化目的：体外研究Atoh7对视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化的调控作用。方法：体外纯化后视网膜Muller细胞诱导去分化为视网膜干细胞；预实验确定感染复数(multiplicityofinfection,MOI)和感染效率。随机将视网膜干细胞分三组：PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染组,PGC-FU-GFP空载体感染组及未感染组。更换分化培养基(DMEM/F12,1ng/mlBDNF,1μMRA,1%FBS)后按分组分别实施干预；倒置相差显微镜下每天观察感染后的视网膜干细胞。分别在7和14天采用免疫荧光细胞化学双标染色检测神经节细胞特异性标记物Thyl.1和Brn-3b,并计算神经节细胞所占百分比；统计学软件采用SPSS13.0,选择one-wayANOVA和Student’st-test进行统计学分析,取P<0.05有统计学意义。RT-PCR和Western-blot检测干细胞向神经节细胞分化过程中Atoh7基因及其下游基因的表达。结果：感染复数为10,FACS检测感染效率为75.41%。分化7天后,免疫荧光细胞化学双标染色结果显示：PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染组中神经节细胞阳性率为50.40±8.22%,PGC-FU-GFP空载体组中神经节细胞阳性率为13.30±13.25%,未感染组中神经节细胞阳性率为9.10±3.21%。PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染组与PGC-FU-GFP空载体组和未感染组比较,差异有统计学意义(F=61.642,P<0.001),而PGC-FU-GFP空载体组与未感染组间差异无统计学意义(P>0.05)。分化14天后结果显示：PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染组中神经节细胞阳性率为49.90±10.16%,PGC-FU-GFP空载体组中神经节细胞阳性率为8.40±2.32%,未感染组中神经节细胞阳性率为8.20±3.19%。PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染组与PGC-FU-GFP空载体组和未感染组比较,差异有统计学意义(F=58.366,P<0.001),而PGC-FU-GFP空载体组与未感染组间差异无统计学意义(P>0.05)。分化后7天和14天比较,对应的三组间差异无统计学意义。RT-PCR和Western-blot检测结果显示,除Notch基因下调外,Atoh7、Brn-3b和Isl-1三种基因均表达上调。结论：Atoh7对视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞的定向分化有正向调控作用,7天分化效率达最大化。Atoh7基因上调其下游基因Brn-3b和Isl-1,同时抑制负调节通路Notch基因。第三章Atoh7调控视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化过程中的信号通路目的：探讨Atoh7对视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化的信号通路。方法：随机将视网膜Muller细胞来源的干细胞分组：A组：Brn-3bsiRNA组(a1组采用Brn-3bsiRNA干预,a2组为无效siRNA对照,a3组为空白对照)；B组：Isl-1siRNA组(b1组采用Isl-1siRNA干预,b2组为无效siRNA对照,b3组为空白对照)；C组：Notch信号通道抑制剂GSI组(c1组采用GSI干预,c2组为空白对照)。按上述分组干预后72h行PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染。感染7天行免疫荧光细胞化学双标染色检测神经节细胞特异性标记物Thy1.1和Brn-3b,并计算神经节细胞所占百分比；统计学软件采用SPSS13.0,选择one-wayANOVA和Student’st-test进行统计学分析,取P<0.05有统计学意义。RT-PCR和Western-blot检测Atoh7、Brn-3b、Isl-1以及Notch的表达。结果：统计结果显示,神经节细胞阳性率分别为：A组(F=58.366,P<0.001)：a1组为23.30%±4.45%,a2组为50.60%±7.04%,a3组为49.70%±7.36%；B组(F=107.771,P<0.001)：b1组为25.90%±3.35%,b2组为49.90%±5.38%,b3组为49.20%±4.64%；C组(t=3.211,P<0.001)：c1组为58.20%±6.46%,c2组为49.40%±5.78%；c1组与a3和b3比较差异亦有统计学意义(F=6.533,P=0.005)。RT-PCR和Western-blot检测结果显示,Brn-3bsiRNA、Isl-1siRNA和GSI均能抑制对应基因的表达。Atoh7可上调其下游基因Brn-3b和Isl-1的表达,同时又能下调Notch的表达。结论：Brn-3b和Isl-1基因沉默可显著抑制视网膜干细胞向神经节细胞定向分化,而抑制Notch基因负调控通路对视网膜干细胞向神经节细胞的定向分化有促进作用,Atoh7和GSI对Notch基因的表达具有显著协同抑制作用。Atoh7、Brn-3b和Isl-1基因的上调和Notch基因的下调共同促进了视网膜干细胞向神经节细胞的定向分化。第四章Atoh7在青光眼模型鼠眼内对视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化的调控作用目的：体内研究Atoh7在青光眼模型鼠眼内对视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化的调控作用。方法：采用激光光凝的方法建立鼠青光眼模型并鉴定；体外诱导视网膜Muller细胞去分化为视网膜干细胞,随机将视网膜干细胞分三组：A组为PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒感染组,B组为PGC-FU-GFP空载体组,C组为未感染组。24h后,采用Accutase细胞分离液将神经球分离成单个细胞,调整细胞浓度为1x104cells/μl;玻璃体腔注射5μ1视网膜干细胞、5μ(1ng/ml)BDNF、30nmolBrdU和100ng(lμM)RA。分别在注射后7天和14天,摘除眼球,冰冻切片行免疫荧光组织化学染色检测视网膜干细胞在视网膜组织中的分化,BrdU检测视网膜干细胞在视网膜中的增殖,RT-PCR和Western-blot检测Nestin、Ki-67、Atoh7以及Brn-3b的表达。结果：激光光凝3天,眼压开始升高,14天达最大值,28天后开始下降,60天后基本恢复至正常；TUNEL染色结果显示,光凝后7天即可检测到神经节细胞的凋亡,随着眼压的持续,凋亡细胞数增多；60天后眼压恢复正常时,但神经节细胞的凋亡仍在持续。视网膜冰冻切片免疫荧光组织化学染色显示,Nestin和Ki-67标记的阳性细胞随时间从玻璃体腔向视网膜深层迁移,并最终聚集于内核层和外核层。注射后14天Nestin和Ki-67mRNA及蛋白的表达量高于7天；A组中Atoh7和Brn-3bmRNA及蛋白的表达量高于B组和C组,同时A组(21.3%±2.0%)中神经节细胞数高于B组(7.9%±1.1%)和C组(7.8%±1.7%)。结论：在青光眼模型鼠眼内,Atoh7亦能有效促进视网膜Muller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化。
【作者】宋伟涛；
【导师】夏晓波；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】Atoh7；Muller细胞；视网膜神经节细胞；干细胞；分化；

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