小分子化合物2BROP对神经干细胞发育的影响及机制研究

【摘要】研究发现,作为胞内生命活动的主要执行者,许多蛋白质只有经历翻译后的加工才能具有生物活性。蛋白质的棕榈酰化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一。DHHC蛋白家族是最早在酿酒酵母中发现与棕榈酰化修饰作用相关的一类蛋白,它们大多具有蛋白质酰基转移酶(proteinacyltransferase,PAT)活性。2004年随着BredtDS研究小组完成人类和小鼠基因组23种DHHC蛋白基因的克隆与鉴定,人们对于这类蛋白功能的了解也逐渐深入。目前,有关棕榈酰化蛋白质组学和棕榈酰化转移酶DHHC家族的遗传学分析结果,暗示蛋白质的棕榈酰化在神经系统发育和相关神经疾病的病发过程中可能起到重要的调控作用。因此,阐明棕榈酰化修饰作用在神经系统中的作用及分子调控机制成为了近些年神经科学领域的研究热点。在中枢神经系统中,神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)属于多潜能干细胞,具有自我更新能力,并且在胚胎发育及成年脑中均能分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs的分化成熟,可以大致分为如下3个阶段：1)NSCs自我更新；2)NSCs被赋予具有分化潜能的神经前体细胞；3)退出周期,处于有丝分裂静止期,分化形成具有特殊形态和功能的神经细胞。其实,在NSCs分化过程中,这些细胞形态和功能的改变很大程度上是由细胞所处不同阶段的特定基因表达模式所决定的。其中,主要包括多潜能因子Sox2、原神经基因bHLH(basicHelix-Loop-Helix,bHLH)家族和细胞周期依赖激酶抑制因子(cyclin-dependentkinaseinhibitors,CKIs)。NSCs自我更新能力及干性维持的内部机制主要是通过多潜能因子的表达和分化命运决定因子的沉默而实现的。NSCs分化命运决定的内部机制也是通过时间和空间上高度精确的调控机制完成的,即分化命运决定因子的激活与表达以及多潜能因子的沉默。目前,研究发现真核基因的表达在多个层次上受到精确的调控,而染色质的修饰是真核基因转录的第一调控靶点。其中,组蛋白的共价修饰对染色质的动态结构具有核心调节作用,它是表观遗传学重要的调节方式之一。在神经细胞命运决定过程中常常伴随着组蛋白乙酰化修饰水平的改变。组蛋白乙酰化转移酶(histoneacetyltransferase,HAT)P300在神经系统中表达丰富,它参与了神经系统在形式和功能上的发生、可塑性和稳态的建立。P300通过自身的HAT活性,乙酰化组蛋白赖氨酸,染色质发生重塑,使转录因子易于与DNA结合,从而促进基因转录。其中,组蛋白H3和H4就是其乙酰化共价修饰的底物之一。本研究中,我们通过建立视黄酸(retinoicacid,RA)诱导的P19细胞定向分化为神经样细胞的体外模型,利用棕榈酰转移酶抑制剂——小分子化合物2-bromopalmitate(2BROP),探讨棕榈酰化修饰在NSCs发育中的作用及相关表观遗传分子机制。第一部分棕榈酰化修饰相关蛋白在神经干细胞发育过程中的表达为了揭示棕榈酰化修饰作用是否参与NSCs发育过程,于NSCs发育的各阶段,包括P19细胞多潜能状态、NSCs增殖和NSCs分化等三个阶段,分别检测23个棕榈酰转移酶即DHHC家族成员的表达情况。结果显示,在NSCs发育阶段,共有20个DHHC家族成员的mRNA表达。其中,DHHC1、4、7、9、24于NSCs发育各阶段的mRNA表达无明显变化。DHHC5、13、14、16、17、20、21成员于NSCs增殖阶段mRNA的表达量获得增高,并且DHHC5、17、21在NSCs分化阶段也将持续性高表达。而DHHC2、6、8、11、15、18、19、23成员的mRNA仅于NSCs分化阶段高表达。接下来,我们利用酰基-生物素交换法(Acyl-biotinylexchangemethod,ABE)技术,检测NSCs增殖与分化两阶段,蛋白棕榈酰化修饰水平情况。结果显示,多种蛋白在NSCs增殖与分化阶段被棕榈酰化修饰,并在不同的NSCs发育阶段,呈现出一定的特异性,如NSCs增殖阶段,棕榈酰化蛋白条带分布于～10、25、45、50、70、170kDa；而NSCs分化阶段,蛋白分布于～25、55、60、70、100、125、150、290kDa。本实验结果显示,大多数DHHC家族成员不同程度的表达于NSCs发育各阶段,并且在不同的NSCs发育阶段,棕榈酰化修饰的蛋白呈现出一定的特异性,暗示DHHC家族成员和它们所介导的棕榈酰化修饰参与NSCs发育过程的调控,棕榈酰化修饰可能通过特异性的影响NSCs发育各阶段中关键蛋白的生物活性,从而参与调控NSCs的命运决定。第二部分小分子化合物2BROP对神经干细胞增殖的作用为了研究棕榈酰化修饰对NSCs增殖的影响,我们首先利用MTT技术,检测不同剂量的2BROP对于细胞代谢活力的影响。结果显示,与对照组(0μM)相比,1-15μM加药组中细胞活力表现出一定的增强；尤其是10uM加药组,但是统计学无明显差异。然而,与对照组相比,25μM和50μM加药组中,细胞活力减弱,MTT值明显降低,并具有统计学显著性差异。与此同时,倒置相差显微镜,观察神经球的结构和形态变化。结果显示,随着RA诱导的进行,对照组中,细胞聚集体不断增大,最终形成一个结构致密、表面规整的细胞团。10μM终浓度加药组组中,细胞聚集体的发生和增长过程与对照组相比,未见异常。但是,25μM加药组中,细胞聚集体的结构发生明显改变,表现为细胞团形态不规则、内部有空隙。接下来,我们利用TUNEL技术,在NSCs增殖阶段,检测小分子化学物2BROP对于细胞凋亡的影响。结果显示,2BROP处理48h后,与对照组相比,10μM加药组中,细胞团中TUNEL阳性细胞数没有明显差异；而25uM处理组中,TUNEL阳性细胞数明显增多。随后,我们利用、VesternBlot和免疫荧光染色技术,检测了相关凋亡信号通路的变化。结果发现,25μM处理组中线粒体相关凋亡通路明显激活。与对照组相比,25μM处理组中抗凋亡Bcl-2的表达量减少,促凋亡的Bax和活化的Caspase3的表达量增多；而10μM加药组中Bcl-2、Bax与活化的Caspase3表达量没有明显变化本实验结果,显示在一定的剂量范围内,小分子化合物2BROP对于NSCs增殖过程,并没有产生明显的影响；而高浓度2BROP将会对细胞产生毒性,引发细胞凋亡。第三部分小分子化合物2BROP对神经干细胞分化的作用为了探究蛋白棕榈酰化修饰在NSCs分化阶段中的相关作用及其分子机制,我们利用免疫荧光技术和WesternBlot等技术,检测神经分化标记物MAP2的表达与分布情况。结果显示,与对照组相比,2BROP处理组中,MAP2阳性细胞数明显减少,统计学具有显著性差异；且神经分化各阶段,MAP2蛋白的表达均受到明显抑制。接下来,利用WesternBlot和qRT-PCR技术,我们检测了NSCs分化命运决定相关因子的表达情况,如多潜能因子Oct4;NSCs标记物Sox2、Nestin;神经前体细胞标记物β-tubulinⅢ和神经分化决定因子Neurogl、NeuroD1。结果显示,随着NSCs命运的获得,对照组与2BROP处理组中,Oct4的表达迅速下降直至消失,无明显差异。与对照组相比,2BROP组中神经前体细胞标记物β-tubulinIII、分化命运决定因子Neurog1和NeuroD1的表达于神经分化各阶段均呈现出明显地降低。与此相反,2BROP处理组中,NSCs标记物Sox2与Nestin却表现出一定的持续性高表达。同时,MTT实验结果显示,与对照组分化各阶段的MTT值无明显变化相比,2BROP处理组中,随着分化天数的延长,MTT值呈现出一定的增。这些结果提示我们,在神经分化阶段,2BROP可能通过增强NSCs的干细胞特性的维持,从而阻碍神经分化的发生。为了验证NSCs分化阶段2BROP是否增强了细胞的增殖能力,我们首先利用BrdU掺入实验,检测分化阶段细胞的增殖情况。结果显示,在神经分化的第四天,与对照组相比,2BROP处理组中,BrdU阳性细胞数明显增多,并且统计学上具有显著性差异。然后,我们利用膜标记-FACS技术追踪细胞增殖的变化。分化阶段的细胞使用荧光染料标记。细胞每增殖一次,荧光强度便会减弱一半。结果显示,悬浮培养24h后,对照组中单个细胞的荧光强度并没有明显的变化；而2BROP处理后,单个细胞的荧光强度发生不同程度的减弱。为了进一步分析2BROP在NSCs分化阶段对于细胞增殖和周期的影响,利用FACS技术,分析分化阶段细胞周期的分布。结果显示,神经分化第四天,对照组中细胞主要分布于G0/G1期；而2BROP处理组中,G0/G1期的细胞数量减少,S期的细胞数量明显增多。与此同时,我们利用qRT-PCR技术,检测了与神经分化相关的CKIs家族成员的表达情况,借以阐明2BROP阻碍周期退出的相关机制。结果显示,与对照组相比,2BRPP处理后,分化相关的CKIs成员的表达受到不同程度的降低。其中,P57的变化最为明显。作为对照,细胞周期增殖标记物Ki67的表达在2BROP处理组中获得了一定的持续性高表达。本实验结果,显示在NSCs分化阶段,2BROP处理后,NSCs通过下调CKIs家族成员,尤其是P57的表达,从而阻碍细胞周期的退出与神经分化的发生,使分化状态下NSCs自我更新能力获得明显的提高。第四部分小分子化合物2BROP对神经干细胞分化表观遗传机制的作用已知,神经分化阶段,介导细胞周期调控的P57的表达依赖于组蛋白H3、H4的乙酰化水平。为了检测组蛋白乙酰化修饰是否参与2BROP介导的神经分化,我们利用免疫荧光、WesternBlot等技术,检测NSCs分化阶段乙酰化组蛋白H3、H4的分布与表达。结果显示,当细胞进入分化阶段时,组蛋白H3与H4的乙酰化水平呈现出一定的上升,但是2BROP处理组中组蛋白H3与H4的乙酰化水平明显的低于对照组的水平。为了进一步验证组蛋白乙酰化修饰是否参与2BROP介导的神经分化,我们使用去组蛋白去乙酰化抑制剂曲古菌素A(TrichostatinA,TSA)预处理细胞,发现TSA处理后,2BROP抑制神经分化的现象得到一定的恢复。值得注意的是,TSA与2BROP共处理组中,β-tubulinⅢ的表达甚至高于正常分化组。接下来,我们免疫共沉淀、ELISA等技术,检测组蛋白H3、H4乙酰化修饰酶P300乙酰转移酶活性。结果显示,与对照组相比,2BROP处理后,P300的乙酰转移酶活性受到明显的抑制。同时,我们利用WesternBlot、免疫荧光等技术,检测了分化阶段P300的表达与分布。结果显示,虽然与对照组相比,2BROP处理组中P300的蛋白表达水平没有明显变化,但是P300在胞内的分布却发生明显的改变。对照组中,P300主要分布于细胞核中,而2BROP处理组中P300蛋白遍布于细胞质和细胞核中。作为脂质化修饰方式之一,棕榈酰化修饰作用参与调节蛋白的胞内分布、物质运输、蛋白间相互作用等过程。接下来,我们探究2BROP是否通过调节P300的棕榈酰化修饰参与调控组蛋白乙酰化修饰与神经分化。首先,我们使用CSS-Palm4.0软件预测P300蛋白是否拥有典型的棕榈酰化位点。结果显示,P300蛋白拥有多个保守性较高的棕榈酰化潜在修饰位点。然后,我们使用ABE方法,检测NSCs分化阶段,对照组与2BROP处理组中P300的棕榈酰化修饰水平。结果显示,蛋白P300可以被棕榈酰化修饰,并且与对照组相比,2BROP处理组中P300的棕榈酰化修饰水平明显受到抑制,统计学上具有显著性差异。本实验结果,显示在NSCs分化阶段,棕榈酰化修饰通过调节表观遗传关键因子P300的脂质化修饰水平,进而影响P300的核转位和HAT活性,最终调节组蛋白H3、H4的乙酰化水平和分化命运相关基因的转录激活。结论神经干细胞的分化、发育与成熟是现代神经生物学研究的热点之一。棕榈酰化修饰作用在神经发育过程中的作用及分子机制尚未阐明。我们建立P19细胞定向分化为神经样细胞的体外模型,利用棕榈酰转移酶抑制剂——小分子化合物2BROP,探讨棕榈酰化修饰在神经发育中的作用及分子机制。利用P19神经定向分化模型,研究发现,DHHC家族成员分别特异性地表达于NSCs的增殖和分化阶段。并且在这些阶段中,许多蛋白发生了明显的棕榈酰化修饰。2BROP(10μM)处理后,NSCs增殖的命运没有发生明显的改变。但是,在NSCs分化阶段,发现2BROP(10μM)处理后,NSCs的神经分化过程和细胞周期的退出受到阻断,而NSCs的数量却维持在一定的高水平状态。进一步的检测,表明细胞周期调节因子CKI家族中P57的表达明显降低。已知,神经分化阶段,P57的表达依赖于组蛋白H3/H4的乙酰化水平。当加入组蛋白去乙酰化抑制剂曲古菌素A(TrichostatinA,TSA)后,发现P57的表达和神经分化得到一定程度的恢复。最终,研究表明在神经分化阶段,2BROP处理后,由于特异性的抑制P300的棕榈酰化修饰水平,影响其核转移,进而阻碍组蛋白H3/H4的乙酰化修饰与神经分化。因此,本研究揭示了一个由基因表达、表观遗传修饰、蛋白翻译后修饰共同参与的神经分化命运决定调控网络。本研究不仅深化了棕榈酰化修饰在神经发育中的作用,拓展了其分子调控机制,同时为研究棕榈酰化修饰作用在组织发育过程中的作用开辟了一个全新的领域、提供了一个新的视野。
【作者】陈学冉；
【导师】郝爱军；
【作者基本信息】山东大学，人体解剖与组织胚胎学，2014，博士
【关键词】棕榈酰化修饰；P57；组蛋白H3/4；P300；神经干细胞分化；

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