铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1 VP22融合基因真核表达质粒的构建与表达

【摘要】目的：构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus1，HSV-1)间层蛋白VP22的融合表达的重组质粒，体外转染，观察其在真核细胞中的表达，为进一步研究铜绿假单胞菌DNA疫苗奠定基础。方法：从铜绿假单胞菌基因组中PCR扩增编码外膜蛋白F的基因序列，然后克隆至真核表达载体pVAX1，构建重组质粒pVAX1-OprF；从重组质粒pcDNA3-VP22中酶切出HSV-1VP22全长基因，然后克隆至真核表达载体pVAX1中，构建重组质粒pVAX1-VP22，利用酶切和序列分析方法验证所构建的载体的正确性。将VP22定向克隆至pVAX1-OprF中，构建pVAX1-VP22-OprF，将OprF定向克隆至pVAX1-VP22中，构建pVAX1-OprF-VP22（由上海生工完成）；同时利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP22蛋白的碳端，然后进行电洗脱得到纯化蛋白，将纯化的重组VP22蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠获得抗VP22多抗血清，采用Westernblot的方法对其特异性进行鉴定。最后，用脂质体法将构建完成的重组质粒转染真核细胞，通过Westernblot检测其在真核细胞中的表达情况。结果：酶切和核酸序列测序证实重组质粒构建完全正确；重组VP22蛋白可在大肠杆菌Rosetta2宿主菌中得到高效表达，得到相对分子质量约30KD的VP22蛋白，纯化的蛋白免疫小鼠后，获得了抗VP22多抗血清。将重组质粒转染真核细胞，Westernblot结果证实重组质粒在真核细胞中得到了表达。结论：成功构建了含有VP22和OprF的双表达载体；建立了HSV-1间层蛋白原核表达系统和成功制备了抗VP22多抗血清；构建的重组质粒可在真核细胞中正确表达，为下一步研究该重组质粒作为DNA疫苗的免疫学效应奠定了良好的基础。
【作者】杨勤；
【导师】周仲辉；雷军；
【作者基本信息】川北医学院，内科学，2014，硕士
【关键词】铜绿假单胞菌；外膜蛋白F；VP22；DNA；疫苗；

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