视黄醇结合蛋白4促高胰岛素血症血管平滑肌增殖作用及机制的研究

【摘要】第一章冠心病合并高胰岛素血症患者血浆视黄醇结合蛋白4水平变化目的：冠心病(coronaryheartdisease,CHD)是冠状动脉粥样硬化斑块破裂伴随血小板聚集、血栓形成,冠脉血管发生不同程度的狭窄乃至完全闭塞,从而导致不同程度的心肌缺血的一组临床综合征。胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)目前已被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和心脑血管疾病的独立危险因素。胰岛素水平不仅与冠心病的患病风险有关,而且与冠心病的预后及冠状动脉的病变程度有关。视黄醇结合蛋白4(Retinolbindingprotein,RBP4)作为新发现的参与胰岛素抵抗的脂肪细胞因子,已被发现与肥胖、胰岛素抵抗、冠心病、代谢综合征等存在着密不可分的关联。但冠心病以及冠心病合并胰岛素异常的患者RBP4水平如何尚未见报道。本章测定冠心病患者以及冠心病合并高胰岛素血症患者血浆RBP4的水平,分析RBP4与血糖及血脂代谢,与胰岛素抵抗的相关性,探讨冠心病与RBP4的关系以及高胰岛素血症对冠心病患者血浆RBP4的影响。方法：收集2009年9月-2010年5月在我院经冠状动脉造影(coronaryangiography,CAG)检查证实为冠心病患者30例(CAD组),冠心病合并高胰岛素患者29例(CAD+HIns组)；另设正常对照30例(对照组)。采用酶联免疫吸附法检测血浆RBP4水平；同时测患者身高、质量,计算质量指数(bodymassindex,BMI),测腰围、臀围,计算腰／臀(waist-to-hipratio,WHR),测收缩压与舒张压；AXSYM全自动标记免疫化学发光仪检测空腹血糖(FastingPlasmaGlucose,FPG)、空腹胰岛素(fastinginsulin,FIns)、餐后2h胰岛素(2-hourpostprandialinslulin,2hPIns),计算胰岛素抵抗指数(homeostasismodelassessment-insulinresistanceindex,HOMA-IR),全自动生化分析仪测定血脂水平以及高敏C反应蛋白(HighSensitivityCReactiveProtein,hs-CRP)、尿酸(UricAcid,UA)、游离脂肪酸(freefattyacids,FFA)等生化指标。结果：1、一般临床资料比较：三组间年龄、收缩压、舒张压以及腰/臀比无显著性差异(P>0.05)。CAD+HIns组的BMI显著高于CAD组和对照组(P<0.01)。2、临床生化资料比较：CAD+HIns组的FIns、2hPIns、HOMA-IR、UA均显著高于其他两组(P<0.01)。CAD+HIns组和CAD组的TG、hs-CRP均显著高于对照组,HDL-C显著低于对照组(P＜0.01)。CAD组LDL-C显著高于对照组(P<0.01)。各组间FPG、TC、FFA差异无统计学意义。3、血浆RBP4的比较：CAD+HIns组显著高于CAD组和对照组(P<0.01),CAD组和正常对照组间无显著性差异。4、血浆RBP4与BMI、TG、UA、hsCRP、FPG、FIns、2hPIns、HOMA-IR呈显著正相关(相关指数分别为r=0.259,P<0.05；r=0.236、r=0.243、r=0.231、r=0.331、r=0.582、r=0.452、r=0.600,P<0.01),与HDL-C呈显著负相关(r=-0.290,P<0.01)。BMI、2hPIns、HOMA-IR是RBP4的独立相关因素(决定系数分别为r2=0.181,P<0.05；r2=0.273、r2=0.516,P<0.01)。结论：合并高胰岛素血症的冠心病患者血浆RBP4水平显著升高,且血浆RBP4与BMI、血脂、尿酸等心血管危险因素正相关,BMI、2hPIns、HOMA-IR是RBP4的独立相关因素。第二章视黄醇结合蛋白4与高胰岛素血症大鼠主动脉血管平滑肌增殖的关系目的：本文第一章研究发现合并高胰岛素血症的冠心病患者血浆RBP4与BMI、TG呈显著正相关(相关指数分别为r=0.259,P<0.05；r=0.236,P<0.01),与HDL-C呈显著负相关(r=-0.290,P<0.01)。亦发现RBP4与炎症因子hsCRP呈显著正相关(r=0.231,P<0.01)。在胰岛素抵抗(IR)致动脉粥样硬化(AS)与冠心病的发病机理中,RBP4与血脂及炎症因子的密切相关提示RBP4可能在AS的发生和发展中起促进作用。那么RBP4与AS的病理基础–血管平滑肌增殖的关联有待进一步研究。胰岛素抵抗时,若胰岛p细胞功能良好,导致机体代偿性出现高胰岛素血症,高胰岛素血症通过Shc/Raf/MAPK途径可加强胰岛素促进血管平滑肌细胞增殖、增加胶原合成,促进生长因子合成的作用,表现为高胰岛素血症致动脉粥样硬化的效应加强；本章研究希望在高胰岛素血症SD大鼠模型上明确RBP4与血管平滑肌增殖是否相关,以及RBP4与VSMC增殖信号转导通路是否有关联,为防治高胰岛素促进血管平滑肌增殖提供新的作用靶点。方法：选取10周龄雄性SD大鼠随机分为两组：即对照组(Congroup)和高胰岛素组(HInsgroup),每组7只。其中高胰岛素组参照文献制作高胰岛素血症SD大鼠动物模型。大鼠尾静脉采血,罗氏血糖仪检测空腹血糖(FPG),Hitach75全自动生化分析仪测定总胆固醇(totalcholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoproteincholesterol,HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol,LDL-C)及高敏C反应蛋白(hs-CRP),采用酶联免疫吸附法检测血浆空腹胰岛素(FIns)和RBP4浓度,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。SD大鼠麻醉后取胸主动脉,行苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色。利用计算机辅助成像系统测算动脉中层厚度(mediathickness,MT),管腔直径(lumendiameter,LD)。提取胸主动脉mRNA及蛋白,采用Real-TimePCR及Werstern-Blot方法测量大鼠胸主动脉细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)mRNA及蛋白的表达。结果：1、HIns组大鼠血浆空腹血糖、胰岛素、HOMA-IR与甘油三酯(TG)均显著高于Con组大鼠(P<0.05),高胰岛素血症SD大鼠模型成功。2、HIns组大鼠TG.hs-CRP显著高于Con组,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著低于Con组(P<0.01)。胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等两组间无统计学差异。3、HIns组大鼠RBP4显著高于对照组(P<0.05)4、HE染色显示HIns组胸主动脉平滑肌增殖明显,HIns组大鼠主动脉中层厚度(mediathickness,MT)、主动脉管腔直径(lumendiameter,LD)较Con组大鼠略有增加,但无统计学意义(P>0.05)。5、HIns组胸主动脉P-ERK1/2mRNA及蛋白表达明显高于Con大鼠(P<0.05),ERK1/2mRNA及蛋白表达两组差异无统计学意义(P>0.05)6、血浆RBP4与MT、P-ERK1/2蛋白表达、P-ERK1/2mRNA表达呈显著正相关。校正FIns值以后,血浆RBP4与P-ERK1/2蛋白表达仍呈显著正相关。结论：高胰岛素血症SD大鼠血浆RBP4水平明显增加,且循环RBP4水平与大鼠胸主动脉平滑肌增殖呈正相关,与平滑肌增殖信号转导通路EPK1/2的磷酸化程度呈显著正相关,校正空腹胰岛素后正相关仍然存在。第三章视黄醇结合蛋白4促高胰岛素诱导血管平滑肌细胞增殖作用及机制研究目的：高胰岛素血症是心血管事件的重要危险因素。本文第一章研究提示合并高胰岛素的冠心病患者血浆RBP4水平显著升高,且血浆RBP4与BMI、血脂、尿酸等心血管危险因素正相关,BMI、2hPIns、HOMA-IR是RBP4的独立相关因素,提示RBP4在AS、CAD的发生发展中可能起重要作用。本文第二章在高胰岛素血症模型大鼠血标本的研究中再次验证血浆RBP4与胰岛素抵抗指标HOMA-IR及炎症相关因子hsCRP呈显著正相关,并且取大鼠主动脉平滑肌进行进一步研究,首次发现循环RBP4水平与血管平滑肌血管壁厚度以及增殖信号—细胞外调节蛋白激酶ERK1/2磷酸化程度正相关,提示RBP4与血管平滑肌细胞增殖密切相关。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的增殖对冠状动脉粥样硬化的形成以及冠心病的发生、发展具有重要意义。VSMC曾殖和迁移与多种信号转导通路有关,其中包括MAPK通路以及JAK/STAT通路。本章采用高胰岛素刺激大鼠血管平滑肌细胞株(Ratvascularsmoothmusclecell,RVSMC),观察RVSMC细胞增殖情况,并首次在平滑肌细胞中采用RBP4作为干预因素,明确RBP4水平与VSMC增殖的因果关系,观察其对RVSMC细胞增殖情况及增殖信号转导通路的影响,以进一步明确RBP4对血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制。方法：培养大鼠血管平滑肌细胞株,分别用不同浓度(0,10-9M,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M)Ins处理不同时间(3h,6h,12h,24h,48h),采用MTT法及流式细胞仪测定细胞周期法观察大鼠血管平滑肌细胞的增殖情况；采用Werstern-Blot法检测大鼠血管平滑肌细胞ERK1/2,P-ERK1/2(磷酸化ERK1/2),JAK2,P-JAK2(磷酸化JAK2),STAT3,P-STAT3(磷酸化STAT3)蛋白的表达。低浓度(1μg/ml)及高浓度(4μg/ml)RBP4预处理大鼠血管平滑肌细胞1h后给予Ins终浓度10-5M处理24h,采用MTT法及流式细胞仪测定细胞周期法观察大鼠血管平滑肌细胞的增殖情况；采用Werstern-Blot法检测大鼠血管平滑肌细胞ERK1/2,P-ERK1/2,JAK2,P-JAK2,STAT3,P-STAT3蛋白的表达。分别予以ERK1/2特异性抑制剂PD980592及JAK特异性抑制剂AG490预处理细胞10min后给予Ins以终浓度10-5M以及RBP4以浓度4μg/ml处理24h,MTT法检测细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：1、Ins可呈浓度及时间依赖性的刺激大鼠血管平滑肌细胞的增殖,以10-5MIns处理大鼠血管平滑肌细胞24h后最为显著。2、RBP4预处理大鼠血管平滑肌细胞1h后,加入10-5MIns继续处理细胞24h,可见大鼠平滑肌细胞增殖能力显著上升。3、Ins可呈浓度及时间依赖性的刺激大鼠血管平滑肌细胞ERK1/2,P-ERK1/2,JAK2,P-JAK2,STAT3,P-STAT3勺表达,以10-5MIns处理大鼠血管平滑肌细胞24h后最为显著。4、RBP4预处理大鼠血管平滑肌细胞1h后,加入10-5MIns继续处理细胞24h,可见RBP4可显著增强Ins诱导的P-ERK、P-JAK2蛋白的表达,对P-Stat3的表达无明显增强作用。5、RBP4能显著增加Ins促平滑肌细胞增殖的能力,预先以ERK1/2抑制剂PD98059处理10min可显著抑制RBP4的该效应,但JAK抑制剂AG490处理对Ins+RBP4诱导的平滑肌细胞增殖无明显影响。结论：胰岛素可呈浓度及剂量依赖性的通过MAPK途径以及JAK2/STAT3途径刺激大鼠血管平滑肌细胞的增殖,而RBP4可通过促进MAPK途径显著增强高胰岛素促血管平滑肌细胞增殖的能力。
【作者】李非；
【导师】杨天伦；夏珂；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】冠心病；视黄醇结合蛋白4；高胰岛素血症；主动脉；血管平滑肌增殖；信号转导通路；ERK1/2；磷酸化ERK1/2；高胰岛素；血管平滑肌细胞；细胞增殖；JAK2/STAT3；

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