基因合成与细菌染色方法学研究

【摘要】合成生物学是以工程学的思想,“从头合成”并且定向改造生物的基因组,从而达到创建新生物元件、代谢途径,以及合成新的生命。人工合成或改造病原微生物的基因组,制备低毒或者无毒的疫苗是合成生物学的重要内容之一。DNA片段体外合成技术是合成生物学实现从头合成和定向改造的有效手段和途径。体外DNA片段合成基于2种基本方法：分别为DNA连接酶的片段连接法和聚合酶链式反应(PCR),上述方法已经被广泛使用。目前用于实验的病原微生物有很多,实验室泄露致命的病原体事件已被广泛报道。实验过程中洒落的病原体培养物、污染物都很容易被人们忽视,为了保证病原微生物实验操作者的安全,需要一种方法来指示和标记病原微生物及其培养物。本研究提出一种高保真DNA单向合成方法(HighfidelityDNAunidirectionsynthesismethod,HFUS法),主要是利用PhusionDNA聚合酶、BsrDI限制性内切酶和Lamda外切酶协同反应,将一条正向寡核苷酸单链和数条反向寡核苷酸单链,通过顺序扩增的方式,最终合成出目标DNA片段。其突出的优势在于可以快速合成长度超过150nt的寡核苷酸单链,其基本原理是向反应体系中投入一条正向寡核苷酸片段seq_F和数条反向寡核苷酸片段seq_r2-r9,首先是寡核苷酸单链seq_f和seq_rl片段互补配对序列彼此接合,在72℃PhusionDNA聚合酶的作用下补齐为双链。接着,50℃BsrDI限制性内切酶识别上一步合成的双链r1末端酶切识别位点,将其特异性切除,从而暴露出DNA反向链上磷酸化的5’端。最后,在37℃Lamda外切酶特异性识别DNA反向链上的磷酸化的单链,并从5’端进行外切,其结果将互补链DNA片段切去部分或者完全切去,此时一次循环结束。下一次循环开始,新合成的seq_f-rl片段下游序列与下一个片段seq_r2的3’端部分序列互补配对并接合后,DNA聚合酶将其延伸,产生seq_f-rl-r2的双链片段,再经酶切和外切后,数次循环后即可产生DNA目标产物。本研究对建立DNA合成方法中寡核苷酸片段的设计及各片段的比例,3种酶的用量及反应时间等参数进行了摸索,并成功合成171bp,340bp,480bp3条DNA片段验证了新方法的可行性。本实验快速合成171bp,340bp,480bpDNA3条DNA片段,探索了一种DNA合成新的方法,为DNA合成方法提供了新的思路。本研究探索了日落黄色素(C16H10N2Na2O7S2)培养细菌的可行性,制备了日落黄色素培养基并成功培养出大肠杆菌DH5a、志贺杆菌、大肠杆菌0157：H7,金黄色葡萄球菌等,在实验中成功将普通微生物和病原微生物做上标记。对培养的大肠杆菌DH5α采用3个稀释度(10-5,10-6,10-7)进行菌落计数,来评价微生物生长状况。绘制菌体的生长曲线采用OD600波长吸收值分析菌体的浊度,结果证明日落黄色素对细菌生长无影响。因此,这种微生物共培养染色标记的方法具有广谱性、高效性、稳定性、安全性和直接性。本实验发现的共培养标记方法具有温和性和新颖性,这种可视化病原微生物培养方法作为实验室安全保障提供了重要的参考。
【作者】吴逊；
【导师】陈惠鹏；
【作者基本信息】安徽大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】病原微生物；高保真DNA合成；微生物染色；

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