RT-LAMP技术快速检测禽流感病毒的研究

【摘要】禽流感(Avianinfluenza,AI)是由正粘病毒科流感病毒属A型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)所引起的一种禽类呼吸道疾病综合征,1878年首次报道于意大利,然后在世界范围内广泛存在,对很多国家和地区的经济增长以及公共卫生安全造成了严重的影响。近年来,由H5N1亚型高致病性禽流感病毒引发的禽流感疫情影响严重,对全球经济增长和人类公共安全已构成了重大威胁,比如1997年香港首次报道的感染人的H5N1亚型禽流感病毒,自2003年以来又在全球15个国家内造成了648人感染、384人死亡的大流行。另外,2005年在中国青海湖爆发的H5N1亚型高致病性禽流感则造成了6000多只迁徙的候鸟死亡。而H7亚型禽流感病毒引起的禽流感大爆发也对许多国家和地区造成了重大危害,导致了七千五百多万的家禽死亡,而且也感染了很多人甚至导致其死亡。此外,2013年中国爆发的人感染H7N9亚型高致病性禽流感病毒的疫情,是全球首次报道,随之在中国多省份相继暴发,到目前为止已经造成超过100人死亡的悲剧。目前禽流感病毒的检测方法主要包括病毒学、血清学和分子生物学等方法,但是其中很多方法操作繁琐,且费时费力,又需要昂贵的仪器设备,因此不适合在基层快速的检测禽流感病毒,也很不利于对禽流感疫情的有效监测和控制。2000年日本NotimiT博士在普通PCR方法的基础上发明了一种新型核酸扩增技术,即环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP),它根据靶序列的六个特定区域设计特异的四个引物,在具有链置换活性的BstDNA聚合酶的作用下,65℃恒温条件反应一小时就可完成目的基因的扩增,并且扩增结果仅用肉眼就能直接判断实验结果,因此LAMP技术具有简便、快速、高特异性和高灵敏度等优点,特别适合在设备不完善的基层实验室使用。本研究在前期LAMP研究的基础上,运用了一种新的扩增产物结果判断方法,即通过实时定量PCR仪观察反应荧光强度变化,并根据此结果判定及优化最佳反应体系。本实验所使用的荧光染料是钙黄绿素,肉眼观察时阳性反应管内反应液颜色会由橙黄色变为浅绿色。本研究以H5亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感病毒的各自HA基因序列以及禽流感病毒的保守M基因序列作为靶基因序列,对它们进行序列比对并找出各自的高度保守区域,然后利用PrimerExplorerV4在线引物设计软件分别设计了针对每个靶基因的多组LAMP特异性引物,每组引物都包括一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LF和LB。对每个靶基因的两组引物进行重复试验,选取最佳的一组引物。然后对反应温度、Mg++浓度、dNTP浓度和甜菜碱浓度等扩增条件进行优化,根据荧光强度变化强弱和1.5%琼脂糖凝胶电泳条带的宽度和亮度进行结果筛选,成功建立了每组引物的最优LAMP反应体系,即M-RT-LAMP的的最优反应体系是：6mM/LMg2+,1.6mM/LdNTP,0.6M/LBetaine,1.6μM/LFIP,BIP,0.2μM/LF3,B3,0.8μM/LLF,LB,最适温度63℃；H5-RT-LAMP的最优反应体系为：6mM/LMg2+,1.4mM/LdNTP,0.8M/LBetaine,1.6μM/LFIP,BIP,0.4μM/LF3,B3,0.8μM/LLF,LB,最适温度65℃；H7-RT-LAMP的最优反应体系是：6mM/LMg2+,1.4mM/LdNTP,0.8M/LBetaine,1.6μM/LFIP,BIP,0.2μM/LF3,B3,0.8μM/LLF,LB,最适温度65℃。在反应前将荧光染料混合液(Calcein/MnCl2)加入到反应体系中,然后将每组反应体系在其最适温度反应60min,然后80℃、5min以终止反应。反应结束后,通过荧光强度变化、肉眼直接观察颜色变化或经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行扩增结果的判断。利用优化后的反应体系,对H1,H3,H4,H5,H6,H7,H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒进行RT-LAMP特异性检测,试验结果只能检测到目的基因的存在,说明所建立的AIV-RT-LAMP方法具有良好的特异性。将各亚型禽流感病毒RNA进行十倍倍比稀释,然后用同一RNA进行RT-LAMP和RT-PCR实验以比较RT-LAMP方法的灵敏性,结果表明本研究建立的M-RT-LAMP体系的灵敏度为0.01pg,是RT-PCR方法的1000倍；H5-RT-LAMP体系其最低检测限为0.1pg,是RT-PCR方法的100倍；H7-RT-LAMP体系其最低检测限是O.1pg,比RT-PCR方法灵敏100倍。用80份临床样品对所建立的AIV-RT-LAMP检测方法进行技术评价,并与RT-PCR方法进行检测阳性率的比较,结果说明本研究所建立的AIV-RT-LAMP技术是有效的且可行的。综上所述,本研究建立的AIV-RT-LAMP快速检测禽流感病毒的方法是可行的,并且该方法具有快速、简便、灵敏度高和特异性好等优势,特别适合在基层及现场使用,为禽流感疫情的预警和早期诊断提供了便利。
【作者】任素玲；
【导师】何宏轩；
【作者基本信息】安徽大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】逆转录环介导等温扩增；快速检测；禽流感病毒；

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