利用荧光纳米粒子快速灵敏检测几种病原细菌研究

【摘要】病原微生物的快速灵敏检测是保证人类及动植物健康的有效手段。细菌是病原微生物最重要的类群,目前常规检测方法的速度和灵敏度都不能满足需求,尤其是对于同一样品中可能存在的多种致病菌往往需要分别进行样品处理和检测,这增加了工作量及检测时间。因此迫切需要建立更加灵敏、快速且能同时检测多种细菌的方法。纳米技术的快速发展为生物分子荧光标记及检测提供了新手段。本论文讨论了制备生物功能化荧光纳米粒子并用于重要食源性致病菌鼠伤寒沙门氏菌快速灵敏检测,并根据荧光共振能量转移(FRET)原理制备了多重荧光纳米粒子,其可在同一波长激光激发而在多个不同波长发射荧光。以鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌为目标细菌,建立了细菌的多重快速灵敏检测方法。主要内容如下：1.采用反相微乳液法制备了以RuBpy染料为核,Si02为壳的荧光纳米粒子,并利用透射电镜和扫描电镜对粒子形态进行了表征。所制备粒子轮廓边缘清晰,基本呈圆形,直径在50nm左右,尺寸均匀性好。2.合成了以TMR染料为核、直径分别为19nm,15nm和13nm的荧光纳米粒子,所含有效荧光分子数量分别约为16,13和5,并发现反应体系中荧光染料的浓度可影响粒子大小及亮度。3.根据FRET原理,将APTS修饰过的FITC,R6G及ROX荧光染料按比例(1：0.5：1,0.5：1：1,0.5：0.5：3)混合,制备了能在同一波长激光激发而在不同波长发射荧光的多重荧光纳米粒子,为多种病原菌的同时检测奠定了基础。4.纳米粒子表面生物功能化修饰及测试对纳米粒子表面进行羧基或氨基修饰并连接抗体,通过与细菌结合并利用扫描电镜观察,比较了三种抗体连接方式(表面羧基直接连接、表面氨基通过亲和素连接、表面氨基通过PEG连接)对其功能的影响,发现PEG连接效果最好。通过对纳米粒子-抗体耦联物的稳定性测试,发现其在4℃可较长时间保存。5.利用纳米粒子对鼠伤寒沙门氏菌的检测通过纳米粒子-抗体耦联物与细菌表面抗原的特异性结合,利用毛细管流式荧光检测仪对整个检测过程实时监控,实现了细菌的快速灵敏检测。本方法极大提高了细菌的检测灵敏度,理论上能够检测样品中单个细菌。该方法不需要细菌的增菌和富集,整个过程需要约30min,速度和灵敏度均超过了现有细菌检测方法。6.多重荧光纳米粒子对细菌的检测将三种不同颜色纳米粒子分别结合鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抗体,对细菌混合液中上述三种细菌同时检测,首次实现了细菌的多重、快速、灵敏检测。
【作者】赵文军；
【导师】谭天伟；朱水芳；谭蔚泓；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2007，博士
【关键词】荧光纳米粒子；细菌检测；鼠伤寒沙门氏菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；

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