微生物中生产辅酶Q_(10)的研究

【摘要】辅酶Q10是线粒体呼吸链中重要的递氢体,是细胞自身产生的天然抗氧化剂,在氧化磷酸化中起着重要的作用,因此辅酶Qi0广泛应用于医药、化妆品行业。本文分别以大肠杆菌(Escherichiacoli)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacients)为研究对象,对代谢调控与基因工程法生产辅酶Q10进行了研究。在大肠杆菌中,将Dps基因和大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接,构建大肠杆菌表达质粒pDPS并成功的检测到辅酶Q10,而且辅酶Q10含量高于辅酶Q8含量。为了建立一个更好的表达系统生产辅酶Q10,我们在大肠杆菌中构建了共表达质粒pDPSa,pDPSca和pDPSg,其中包括辅酶Qi0代谢途径中的基因ubiC,ubiA和ubiG。重组菌pDPSca辅酶Q10含量分别是重组菌pDPS和pDPSa含量的3倍和5倍。说明UbiCA和UbiA对辅酶Q的合成起到促进作用,而表达UbiG对辅酶Q的合成没有明显影响。根据对重组菌pDPSca进行的四种批次发酵,为进一步提高辅酶Q10产量,进行了高密度发酵研究。以葡萄糖做碳源高密度发酵培养重组菌BL21/pDPSca,当发酵到32.5h时,生物量和辅酶Qi0产量达到最大值,分别为84.5g/L(drycellweight)和50.29mg/L。以甘油为底物生产辅酶Q10时细胞干重和辅酶Qi0最高浓度分别为94.58g,L和45.86mg/L。在整个发酵过程中质粒稳定性保持在较高水平。克隆并表达裂殖酵母全长ppt1基因(MTpptl)和定位到内质网的pptl基因(ERppt1),重组菌pMTppt1和pERppt1辅酶Q10含量为0.45mg/g和0.65mg/g,分别比对照菌pESPM的辅酶Q10含量提高了3.7倍和5.1倍。重组菌比对照菌具有更好的抗氧化性和抗逆性：在有H2O2,Cu2+,NaCl或低温22℃培养时,重组菌长势明显好于对照菌。在5L发酵罐中对重组裂殖酵母pERppt1进行了研究,通过乙醇浓度直接反馈流加操作,实现了重组裂殖酵母高密度发酵生产辅酶Q10。并总结了酵母高密度发酵生产辅酶Q10过程中各种过程参数之间的变化关系,这些参数包括：容氧、pH、乙醇浓度、摄氧率、二氧化碳释放率、呼吸熵。经过90h发酵培养,最终菌体干重为57g/L,辅酶Q10产量为24mg/L。而且在整个发酵过程中质粒稳定性保持在较高水平。植物表达载体pBIl21中的真核表达启动子CaMV35S换成农杆菌Ti质粒上的组成型启动子VirA-P实现在农杆菌中表达多个辅酶Q10代谢途径中相关基因,构件重组农杆菌菌株pBIV-dps,pBIV-dpsq,pBIV-dpsp,pBIV-dpsca,从而提高辅酶Q10产量,被克隆到重组农杆菌中的基因有：农杆菌dps基因、大肠杆菌ubiCA基因、裂殖酵母pptl基因、酿酒酵母coq2基因。其中重组菌pBIV-dpsca辅酶Q1o含量最高(2.18mg/g)。在批次补料耗氧培养条件下,发酵最终重组菌pBIV-dpsca辅酶Q1o产量为33mg/L是出发菌pBI121的1.52倍。在微氧条件下,重组菌pBIV-dpsca辅酶Q1o产量为66.8mg/L,辅酶Qio含量和产率为2.28mg/g和0.37mg/L·h分别比耗氧条件提高2.19倍和1.85倍。
【作者】张大伟；
【导师】谭天伟；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2007，博士
【关键词】辅酶Q10；克隆；共表达；亚细胞定位；抗氧化；补料批次发酵；大肠杆菌Escherichiacoli；裂殖酵母Fissionyeast；根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens；

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