枯草芽孢杆菌ldh基因的敲除及丙氨酸生产

【摘要】枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是芽孢杆菌属中的一种,为革兰氏阳性菌,细胞壁不含内毒素,能形成芽孢,被FDA认为是安全菌株(GRAS),可以代谢多种糖,能够合成多种蛋白酶并能把它们分泌到细胞外。对该菌株的研究多集中在其α-淀粉酶和中性蛋白酶上。丙氨酸,一种脂肪族的非极性氨基酸,是哺乳动物非必需氨基酸,在生物体的代谢中有重要的作用,在食品工业和医药上都具有重要意义。本研究旨在敲除B.subtilisIBL23染色体上丙氨酸合成的支路代谢基因L-乳酸脱氢酶(ldh),研究ldh基因的缺失对丙氨酸产量的影响。本文还对葡萄糖对丙氨酸产量的影响做了一些探讨。以B.subtilisIBL23基因组DNA为模板,PCR扩增得到ldh基因,将ldh基因连接到载体pTG19-T上,在大肠杆菌IBL15中转化,蓝白筛选得到重组质粒pTG19-T然后以质粒pKD3为模板,PCR扩增得到cm基因,将cm基因用NdeI和EcoRV双酶切后连接到重组质粒pTG19-T-ldh上,在大肠杆菌IBL15中转化,通过氯霉素抗性筛选得到打靶载体pTG19-T-ldh::cm。通过Spizizen法把pTG19-T-ldh::cm在IBL23中转化,成功敲除IBL23染色体上的ldh基因,获得了L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23△ldh。IBL23和IBL23△ldh在形态方面的区别是：IBL23△ldh中有的菌为椭圆形,而IBL23中多为杆状。这两株菌在LB培养基中培养72小时,IBL23培养36小时后菌浓达到最高,此时OD600为4.62±0.23;培养48小时后菌浓降低,此时OD600为3.70±0.03。IBL23△ldh培养12小时后茵浓达到最高,此时OD600为4.45±0.07,72小时后茵浓降低,此时OD600为1.36±0.10。IBL23培养72小时后pH为9.44±0.01,而此时IBL23△ldh的pH为9.71±0.01。敲除ldh基因后可以使丙氨酸产量提高2.43倍,IBL23△ldh发酵72小时丙氨酸产量达0.212g/L,而此时IBL23中丙氨酸的产量为0.087g/L。葡萄糖对丙氨酸产量影响的实验中发现添加20g/L葡萄糖72小时后IBL23的丙氨酸产量提高了1.5倍,由不加葡萄糖的0.094g/L变为添加葡萄糖的0.143g/L。添加葡萄糖72小时后IBL23△ldh的丙氨酸产量提高了3.3倍,丙氨酸产量由不加葡萄糖的0.204g/L变为加葡萄糖的0.674g/L。
【作者】曹杰；
【导师】童望宇；
【作者基本信息】安徽大学，生物化学及分子生物学，2013，硕士
【关键词】L-丙氨酸；基因敲除；L-乳酸脱氢酶；

【参考文献】
[1]褚宏状.我国野生动物致人损害补偿制度研究[D].苏州大学,法律,2012,硕士.
[2]乔苹.我国城市公共危机治理中的公民参与机制研究[D].首都经济贸易大学,行政管理,2013,硕士.
[3]蒋帅.沈阳市于洪区农村小学学校体育现状调查与分析[D].沈阳体育学院,体育教学,2014,硕士.
[4]左丽君.帕金森病患者伴发疲劳的临床特点及潜在机制的研究[D].首都医科大学,神经病学,2014,硕士.
[5]王学荣.马克思主义生产力理论的当代转换：从传统到生态[D].首都师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[6]蔡志辉.低铝低硅TWIP钢的组织与性能研究[D].东北大学,材料加工工程,2011,硕士.
[7]耿涛.ECG波形可视化聚类策略研究[D].天津理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[8]谷艳博.上海日资企业空间组织研究[D].华东师范大学,区域经济学,2013,硕士.
[9]闫博,张龙梅,张俊豪.催化分解二茂铁制备碳纳米片及其结构表征[J].江苏科技大学学报(自然科学版),2014,04:337-341.
[10]李延涛.植物油纸绝缘的微水扩散和介电特性研究[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[11]黄慧霞.基于细菌觅食算法的知识员工任务指派及调度研究[D].天津商业大学,企业管理,2013,硕士.
[12]童晓莹.两种粒子复配对导电硅橡胶各性能影响的研究[D].南京理工大学,2014.
[13]唐进元,范文学.氧化铝铁路罐车流态化卸车分析[J].铁道运营技术.2006(01)
[14]龙辉.基于EMS一体化的在线继电保护校核系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[15]陆国平.浅析研究生电子档案的管理[J].档案与建设,2004,09:46-47.
[16]袁中友.厄尔尼诺和拉尼娜事件与广东省干旱关系探讨[D].华南师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[17]徐涛.论针对儿童的家庭暴力防治体系的构建[D].南京大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[18]马文峰,杜小勇.论数字资源整合的方法与技术基础[J].中国图书馆学报,2005,06:49-53.
[19]本报通讯员玄宣本报记者马道军.创新成为玄武经济转型升级主引擎[N].南京日报,2015-03-02A01.
[20]张毅.HB公司成品油管道巡检管理信息系统的开发与实施[D].河北工业大学,工商管理,2013,硕士.
[21]韦立新.西气东输长江穿越工程若干关键技术问题的研究[D].河海大学,水利工程,2003,硕士.
[22]孙晨宇.超高压输电线路继电保护的研究[D].兰州理工大学,电气工程,2013,硕士.
[23]李金晓.金融监管国际合作研究[D].天津财经大学,国际法学,2012,硕士.
[24]张程.建构主义观点下的数学创造性思维的研究[D].首都师范大学,2002.
[25]王晓丹.论我国网络广告的问题及其法律监管[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[26]廖国威.基于数据挖掘的分布式入侵检测系统研究[D].西北工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[27]蔡子鸿.马克思与罗尔斯正义思想比较[D].吉林大学,伦理学,2013,硕士.
[28]袁园.我国制造业集聚的时空演进特征与影响因素研究[D].华中师范大学,区域经济学,2013,硕士.
[29]孙泽玉.元代楷书押印论述[D].首都师范大学,美术,2014,硕士.
[30]王清.现代中小学校长用人策略的研究[D].西南师范大学,2004.
[31]孙世权.多配送中心车辆路径优化问题的研究[D].西安电子科技大学,运筹学与控制论,2012,硕士.
[32]蒋天榕.基于数据仓库的银行DSB系统设计与实现[D].厦门大学,计算机技术,2014,硕士.
[33]陈松.七氟醚后处理对体外循环犬肺保护作用及机制的实验研究[D].遵义医学院,麻醉学（专业学位）,2014,硕士.
[34]赵浩亮.基于LMS自适应时延估计和ARM的三相流流量测量系统研究[D].燕山大学,电路与系统,2014,硕士.
[35]莫海萍.任务型教学法在初中英语语法教学的应用[D].广西师范大学,学科教学,2013,硕士.
[36]葛明宜.论我国行政复议委员会的构建[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[37]张志明.中国服务贸易的服务业就业效应研究[D].辽宁大学,国际贸易学,2014,博士.
[38]罗遥凌.电脉冲用于水泥基材料TSA加速研究[D].重庆大学,材料工程（专业学位）,2014,硕士.
[39]黄纬.上下文感知的普适服务组合研究[D].江苏大学,2008.
[40]姚瑜婷.泉州“金改”背景下的民间资本：规模、流向与金融效应[D].华侨大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[41]王郭亦然.我国刑法禁止令研究[D].贵州民族大学,刑法学,2014,硕士.
[42]陈鑫.小型高温超导直线感应电机样机的设计与测试[D].西南交通大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[43]贡媛媛.哲学史中的康德哲学主体性思想[D].安徽大学,外国哲学,2004,硕士.
[44]吴超.预应力混凝土连续梁桥施工控制仿真计算及零号块局部应力分析[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[45]刘开丽.粒子群优化算法的研究与应用[D].安徽大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[46]齐勤.中国英语专业学习者英语口语中因果性话语标记语研究[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[47]夏雯蓉.耐辐射球菌中丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶家族基因的初步研究[D].浙江大学,生物物理学,2012,硕士.
[48]杨灏.基于太赫兹的制药材料光谱测量[D].华中科技大学,光电信息工程,2013,硕士.
[49]张国昀.交通运输燃油消费端替代方式分析及建议[J].当代石油石化,2015,03:36-41.
[50]史定华.可修排队系统GI／G（M／G）／1的可靠性分析[J].自动化学报,1995,06:658-667.