纳米磷酸钙介导p53基因抑癌效果的研究

【摘要】基因治疗是将目的基因整合到基因载体上,通过转染癌细胞表达目的蛋白实现抑癌效果的治疗方法。目前,选择合适的基因载体是实现抑癌效果的关键因素之一。本论文采用纳米羟基磷灰石(HAp)用作基因载体,研究纳米HAp的形状、粒径对其携载pEGFP-Cl-p53后(简称：HAp-p53)体内外抑癌效果的影响。采用活体成像和透射电镜(TEM)技术研究了不同形状、粒径的纳米HAp在体内的分布、降解以及肿瘤靶向性。研究证实球形纳米羟基磷灰石(S-HAp)有良好的抑癌效果,具有肿瘤靶向性。本论文为纳米HAp作为基因载体用于癌症治疗研究提供实验依据,为研究无机纳米颗粒在体内的分布与代谢提供新方法。方法：1)制备不同形状、粒径的纳米HAp,研究温度、pH对其形状、粒径等性质的影响,通过场发射扫描电镜(SE-FEM)、透射电镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)以及粒径分析仪等表征技术分析制备的HAp的理化性质,建立稳定制备纳米HAp的方法。2)采用1%琼脂糖凝胶电泳的方法研究了不同形状、粒径对纳米HAp携载pEGFP-Cl-p53(pDNA)量的影响作用,研究不同温度(37℃、4℃)对纳米HAp携载pDNA的影响。3)通过荧光显微镜和流式细胞仪检测技术,比较PEI修饰前后对纳米HAp携载pEGFP-C1(简称：HAp-pEGFP,HAp-PEI-pEGFP)对癌细胞的转染效率及绿色荧光蛋白(GFP)表达的差异。4)通过MTT法检测纳米HAp和HAp-PEI携载pEGFP-Cl-p53(简称：HAp-p53,HAp-PEI-p53)体外杀伤癌细胞的能力及对正常细胞的毒性；采用Hocehst33348染色和Westernblot研究其抑癌机理。5)构建BalB/C小鼠乳腺癌4T1/luc移植瘤模型,研究四种HAp-PEI-p53的体内抗癌效果。通过测量肿瘤体积、小鼠存活率研究四种HAp-PEI-p53的抑癌效果和生物安全性；采用活体成像技术(IVIS)深入分析并比较四种HAp-PEI-p53处理后小鼠的肿瘤转移情况,并通过肿瘤组织切片HE染色、P53蛋白免疫组化(P53IHC)、DNA断裂3’OH原位杂交实验(TUNEL)和透射电镜(TEM)等技术分析HAp-PEI-p53的抑癌机理。6)采用近红外荧光染料DiR标记纳米HAp。通过尾部静脉将标记的纳米HAp注射到ICR小鼠体内。采用IVIS和TEM分析不同性质的纳米HAp在体内的分布；观察S-HAp在体内的降解和肿瘤靶向性等代谢信息。结果：1)通过添加不同的有机基质,控制pH、反应温度等条件合成了四种形状的的纳米HAp,分别为：球形纳米HAp(S-HAp),针状纳米HAp(N-HAp),棒状纳米HAp(R-HAp)和短棒状纳米HAp(SR-HAp),其平均粒径为：100nm、200nm、50nm和40nm。2)不同形状的纳米HAp携载pEGFP-Cl-p53(p53)量有明显差异,等浓度、体积条件下,S-HAp和N-HAp携载pDNA的能力更强；同时低温处理可提高HAp携载pDNA的效率。3)S-HAp、N-HAp、R-HAp和SR-HAp的转染效率约为1%,而S-HAp-PEI,N-HAp-PEI、R-HAp-PEI和SR-HAp-PEI转染效率分别为13.0%、14.6%、9.5%和15.5%,显示PEI修饰可显著提高载体的转染效率。4)体外抑癌实验证实,HAp-p53无明显抑癌效果,而经PEI修饰后的HAp可有效杀伤Hep-3B、HuH-7和Bel-7404等多种癌细胞,并且HAp-PEI本身具有良好的生物相容性。5)HAp-PEI-p53能有效抑制肿瘤的生长和转移,可延长荷瘤小鼠的生命。其中N-HAp抑制肿瘤转移的效果最佳,S-HAp次之,而R-HAp和SR-HAp对肿瘤转移的抑制效果较弱。6)粒径为40-200nm之间的S-HAp、N-HAp、R-HAp和SR-HAp的纳米颗粒仅分布在肝脏中,在小鼠体内的降解周期约为3周,且颗粒具有肿瘤靶向性。
【作者】赵瑞波；
【导师】孔祥东；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】癌症；基因治疗；HAp；pEGFP-C1-p53；HAp体内观察；

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