荧光PCR熔解曲线法快速诊断耐药结核病的临床应用评估

【摘要】本文主要包含两个部分,第一部分建立了一种磁珠法提取结核分枝杆菌核酸的方法,并对其进行优化,证明了其有效性。第二部分通过检测临床标本,对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药突变试剂盒进行了较全面的评估,阐述了该试剂盒在临床应用中的优缺点。结核分枝杆菌的细胞壁厚,难以破裂,同时,结核病患者的痰液中含有大量的呼吸道分泌物及粘蛋白等成分,这些因素对结核分枝杆菌核酸的提取带来了不利影响,直接影响了后续的快速诊断。我们建立了一种利用磁珠进行吸附的提取方法,通过加热和裂解液对结核分枝杆菌进行破壁,依靠磁珠对核酸的吸附能力,多次洗脱痰液中残留的抑制成分,最终得到质量较高的核酸。我们对提取过程中的加热时间,液化液用量以及裂解洗脱次数进行了优化,最终得到了较为完善的提取方案。通过模拟阳性痰液我们考察了该方法的灵敏度,结果显示,在200CFU/mL以上含量的痰液中提取的核酸都能有效的进行PCR扩增。我们还对140份临床标本进行了提取检测,其中85份镜检阳性标本中都能有效提取到核酸进行PCR扩增检测,灵敏度达到100%,镜检阴性痰中也有提取到,这可能是由于抗酸染色镜检的局限性以及PCR检测方法的特异性造成的。我们对200份临床标本进行了药物敏感性试验和四种(利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇)荧光PCR熔解曲线法检测试剂盒快速检测。对结果进行了一个对比,结果发现,利福平突变检测试剂盒的灵敏度为100%,特异性为97.8%；异烟肼突变检测试剂盒的灵敏度为94.4%,特异性为98.8%；链霉素突变检测试剂盒的灵敏度为85.3%,特异性为98.2%；乙胺丁醇突变检测试剂盒的灵敏度为90.9%,特异性为97.9%。表明四种试剂盒的特异性均较高,其中利福平突变检测试剂盒的灵敏度最高。该结果表明四种试剂盒在灵敏度和特异性方面具有较好的性能。我们还通过对605份临床标本的检测,从检测时间、检测水平、试剂盒稳定性、污染情况、不同仪器的对比、结果判读复杂性等多个方面对六种试剂盒进行了考察评估。从临床标本核酸的提取到完成六种药物突变检测,在2-3天内即可完成,与传统的药敏试验相比大大缩短了检测时间,这是荧光PCR熔解曲线法检测耐药情况具有的最大优势。我们对六种试剂盒的检测水平进行了考察,每种试剂盒的检测底线略有不同,其中氟喹诺酮突变检测的水平最强。我们对放置10天、一个月、二个月、三个月的试剂盒进行了评估,发现三个月内试剂盒检测性能变化不大,第三个月时开始出现小幅下降。在污染方面,六种试剂盒发挥了良好的性能,整个检测过程中只出现了3次污染,而传统培养和药敏试验有15次污染。在上述的评估中,试剂盒都发挥了其优秀的性能,但是,试剂盒在结果判读方面还有需要改进的地方,容易出现一些难以判定的结果,对结果判读人员的理论知识有一定的要求。综合多方面的评估结果,我们认为,荧光PCR熔解曲线法是简单快速、可靠实用的检测技术,基于该方法的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、能有效避免污染的优良特点,具有较好的临床应用意义。
【作者】崔文彬；
【导师】牛建军；
【作者基本信息】厦门大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】熔解曲线法；结核分枝杆菌；评估；

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