柞蚕滞育关联蛋白3的表达与功能研究

【摘要】从NCBI检索到一条柞蚕滞育关联蛋白3（diapauseassociatedprotein3，DAP3）的基因序列（GenBank登录号为AFC35302.1），生物信息学分析表明该基因序列全长572bp，开放阅读框（openreadingframe，ORF）516bp，编码含有171个氨基酸残基的蛋白，预测其分子量大小及等电点分别为18.19kDa和6.1。保守结构域预测发现其含有Cu/Zn-SOD的保守结构域；通过与其它物种SOD的多序列比对，发现Ap-DAP3与SOD有着高同源性。与家蚕滞育时钟蛋白TIME-EA4的空间结构比对表明两者具有高同源性，推测其可能在滞育解除过程中发挥类似的功能。通过RT-PCR扩增出Ap-dap3基因，构建重组的原核表达载体pET-28a（+）-Ap-dap3，转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3），经IPTG低温诱导后于上清和包涵体中均有表达。选择破菌后上清液进行镍柱亲和层析，纯化HIS-DAP3融合蛋白，其纯度可达到92%。纯化后的蛋白用以免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，ELISA检测抗体效价为1：6400，Westernblot分析表明抗体特异性良好。提取柞蚕不同发育时期和五龄幼虫不同组织的总RNA和总蛋白，分别用荧光定量PCR和Westernblot的方法对Ap-dap3进行基因表达动态分析。结果表明：在滞育蛹解除滞育并发育成蛾的过程中，Ap-dap3的表达在mRNA和蛋白水平都逐渐下降；此外，在柞蚕蛹、卵以及一至五龄幼虫的发育过程中，Ap-dap3的mRNA表达丰度幼虫期很高，尤其是在一龄幼虫和五龄幼虫体内；但是相应的AP-DAP3蛋白的表达量在幼虫期要明显低于蛹期，且在二、三、四龄幼虫中没有检测到DAP3的表达；在柞蚕五龄幼虫各组织中Ap-dap3基因的转录水平存在着较大的差异，由高到低依次为脂肪体、马氏管、卵巢、气管。其他组织中mRNA含量极低；而AP-DAP3蛋白在柞蚕五龄幼虫的表皮、头和血淋巴中表达量最高，其次是脂肪体，而在其他组织中没有检测到该蛋白的存在。将纯化后的重组蛋白HIS-DAP3进行SOD活性检测。发现其活性达到667.4U/mL；此外，对新鲜柞蚕蛹进行紫外照射，建立氧化应激模型，分别检测模型组中Ap-dap3的mRNA和蛋白表达水平的变化以及总蛋白中SOD活性的变化。发现在mRNA水平，Ap-dap3的表达在紫外照射10min，20min和30min组中均有显著升高，在紫外照射20min时达到最高；在蛋白水平，相对于未经照射的对照组，AP-DAP3的表达在各个照射组均有显著升高。总蛋白的SOD活性检测表明：在紫外照射10min后，SOD活性显著升高，随着照射时间的延长，SOD活性反而下降，直至与对照组的活性相似。总体来说，紫外的照射能引起柞蚕蛹的氧化应激反应，在氧化应激过程中会产生SOD以清除超氧离子自由基，而AP-DAP3水平的升高很好的暗示其可能在以内发挥SOD活性。
【作者】毕臻乐；
【导师】舒建洪；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】柞蚕；DAP3；原核表达；表达谱分析；SOD活性；

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