新鞘氨醇杆菌US6-1降解HMW-PAHs的代谢路径和转录调控研究

【摘要】多环芳烃（PAHs）是一类在环境中广泛分布的有机化学污染物,具有“三致”（致癌、致畸、致突变）效应,通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。目前研究结果表明,微生物的降解与转化是消除PAHs污染的有效方式之一。以苯并芘（BaP）为代表的高分子量PAHs（HMW-PAHs）因其结构稳定、难降解,可在环境中长期存在。能以BaP为唯一碳源和能源进行矿化的微生物研究报道较少,代谢路径也不够清楚。本论文以一株筛选自海洋环境的、高效的PAHs降解菌NovosphingobiumpentaromativoransUS6-1为模式菌株,结合实时荧光定量PCR技术和链特异转录组测序技术,针对其对菲（Phe）、芘（Pyr）和苯并芘的降解特性,降解关键酶在不同PAHs诱导下的差异表达,质粒pLA1在芳烃降解中的作用,以及在苯并芘胁迫条件下生理应答过程等进行了较为系统的研究。主要研究结果如下：1.采用GC/MS技术,检测了新鞘氨醇杆菌US6-1对Phe、Pyr和BaP的降解能力,结果显示：US6-1分别在24h,48h和6d培养后,对起始浓度为10ppm的菲、芘和苯并芘的降解率可达99.02%,52.88%和14.54%。说明新鞘氨醇杆菌US6-1能以Phe、Pyr和BaP为唯一碳源和能源生长,在培养12h、48h和6d后已经分别启动了对Phe、Pyr和BaP的降解；2.对新鞘氨醇杆菌US6-1基因组进行分析,发现了两条中心代谢路径,分别为原儿茶酸代谢路径和邻苯二酚代谢路径。其中原儿茶酸代谢路径的基因主要分布在在染色体上,而邻苯二酚代谢路径的关键基因主要分布在质粒pLA1上。应用SDS-变温法得到了一株敲除质粒pLA1的突变株CPUS6-1,比较US6-1和CPUS6-1在降解16种芳烃（苯并[a]芘、芘、菲、蒽酮、1-羟基-2萘甲酸、1-萘酚、2-萘酚、萘、水杨酸、邻苯二酚、苯甲酸、龙胆酸、4-羟基苯甲酸、原儿茶酸、邻苯二甲酸、间苯二酚）时的差异,证实了邻苯二酚代谢路径存在于质粒pLAl上,同时发现了质粒pLA1在芳烃降解中起着关键作用。我们还发现US6-1能降解龙胆酸,但是CPUS6-1却不能降解,说明有一条未知的龙胆酸代谢路径存在于质粒pLA1上,或者质粒pLAl控制着龙胆酸降解路径基因的表达;3.对新鞘氨醇杆菌US6-1的基因组中降解PAHs的功能基因进行进一步分析,发现了17个具有环羟基化双加氧酶（RHOs）保守结构域的基因,经过ClassRHO软件分析后,17个RHOs中有7个得到了准确分型。除RHOs外,对质粒上分布的其他降解基因及调控基因,在PAHs降解时mRNA水平上的表达差异进行了跟踪,结果显示：RHOtypeINSU3626的表达量和未得到分型的RHONSUPLA1141与其他两种类型的RHOs明显不同,而其它基因的表达模式基本相同,均是在Phe和BaP降解条件下基因的表达量高于Pyr。4.在以BaP为唯一碳源和不添加任何碳源的条件下,以细菌全局调控系统的关键基因为分子标记,应用链特异转录组测序技术结合实时荧光定量PCR技术,跟踪高分子量PAHs（BaP）胁迫下,US6-1在饥饿应答、群体感应以及启动细胞程序性死亡等应急反应过程中的基因表达差异,结果显示：针对OD600、ETSA和CFU进行了检测,发现新鞘氨醇杆菌US6-1在培养过程中,其OD600值变化不大,而CFU变化幅度较大,由此我们可以得出新鞘氨醇杆菌US6-1会从可培养状态变为不可培养状态以适应不适环境；针对降解路径中的降解基因和应急反应调节基因进行了相对基因表达含量测定,结果表明新鞘氨醇杆菌US6-1在BaP组和Control组内降解基因的表达和应急反应调节基因的表达有相似之处,都可调控自身的基因表达对不良环境的变化做出有效应答。
【作者】杨璐溪；
【导师】田蕴；
【作者基本信息】厦门大学，水生生物学，2014，硕士
【关键词】新鞘氨醇杆菌；高分子量多环芳烃(HMW-PAHs)；代谢路径；应急反应；转录组；

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