刃天青显色法和Dxr酶抑制剂模型对海洋真菌来源抗弧菌活性物质的高通量筛选

【摘要】弧菌病是水产养殖业最重要的细菌病之一,其爆发后死亡率高,给我国水产养殖业造成重大经济损失。人们为了防治水产动物弧菌病,大量盲目使用抗生素,使耐药性菌株不断出现,使病害更加难以控制,需要不断地寻找新的、安全的抗菌药物。海洋真菌因其独特生长代谢机制,具有产生大量结构新颖、活性强的化合物的潜力,成为当下国内外学者研究的热点。本研究以筛选抗弧菌的活性化合物为目标,建立刃天青荧光高通量微量显色法,优化刃天青显色法实验条件,并对比平板稀释法,评价了刃天青方法在测定药物对弧菌最低抑菌浓度(MIC)实验中的适用可行性,并实现了对来源于32株海洋真菌的916个初级馏分的活性筛选,具有直观、可靠、灵敏、微量、经济等优点。根据筛选结果和相关文献报道挑出尖刀镰孢菌、白色侧齿霉、黄曲霉三株真菌进行重新发酵,利用正相反相柱层析、TLC、HPLC方法分离出次级馏分,用刃天青显色方法进行活性跟踪,从白色侧齿霉发酵物中分离出对供试弧菌均有抑菌活性的新化合物EngyodontiuminA。萜类化合物及其衍生物是自然界分布最广泛、结构最复杂的一类次生化合物。生物体内的萜类化合物主要有两种生物合成途径：甲羟戊酸途径(mevalonatepathway,MVA)和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(2-methyl-D-erythritol-4-phosphatepathwayMEP)。研究表明,MEP途径广泛存在于大多数致病菌、藻类、地衣及高等植物等,但目前尚未在人体和动物中发现该途径,因此该途径的关键酶已成为潜在抗菌素、抗疟药物和除草剂的靶点。1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)是该途径中第一个限速酶,本实验克隆和表达创伤弧菌DXR蛋白并优化其酶活测定方法,在此基础上建立弧菌DXR抑制剂高通量筛选模型,并对利用刃天青筛选出的有抗菌活性的20个次级馏分进行DXR酶活性研究,获得2个阳性馏分,在进一步的深入研究中有望于从这些馏分中找到DXR酶的有效抑制剂,同时揭示其抗微生物的可能分子机制。两种方法为新型抗菌药物或先导化合物发现提供了依据。
【作者】李芊；
【导师】王义权；陈建明；王蔚；
【作者基本信息】厦门大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】海洋真菌；高通量筛选；刃天青；DXR；

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