产环氧化物水解酶重组大肠杆菌的构建及发酵研究

【摘要】环氧化物水解酶(EC3.3.2.3)是一类不需要金属离子和辅因子参与就能催化水分子加成到环氧化物上产生相应的连二醇的酶,广泛存在于生物体内,如哺乳动物、昆虫、植物和微生物等。目前,大部分关于环氧化物水解酶的研究主要集中在哺乳动物,但由于其来源和产量的限制,使得它们并不能被广泛应用于工业生产。而微生物环氧化物水解酶可以通过高密度发酵大量得到,不受来源和产量的制约,为工业生产开辟了新的途径。本研究将全合成的产D(-)-酒石酸环氧化物水解酶基因连接至JpET-28a(+)载体,得到重组质粒pET-28a(+)-CESH,然后将重组质粒转入宿主茵E.coliRosetta(DE3)中,成功构建了重组大肠杆菌并且在全合成培养基上对重组大肠杆菌表达外源蛋白的条件进行了优化,包括诱导剂浓度,诱导时机和诱导后培养温度。最优表达条件为,对生长前中期对重组菌进行诱导,诱导剂浓度为0.2mM,诱导后培养温度为28℃。研究了不同甘油浓度对重组大肠杆菌的影响,发现浓度较低时(<40g·L-1),甘油对菌体生长的抑制作用相对较轻,而浓度较高时(>80g·L-1,),甘油的抑制作用则非常显著,比生长速率明显下降。因此,在进行发酵罐放大培养时,初始甘油浓度选择30g·L-1。在15L发酵罐上进行放大培养,分别进行了批次发酵、分批补料发酵和变速流加补料发酵。对比分批补料和批次发酵,前者生产率达6.71×105U·(L·h)-1,比批次发酵提高了33.3%,酶活达到2.0×107U·L-1所用的时间,比批次发酵缩短了10h;而变速流加补料发酵与分批补料相比,最高酶活力几乎没有增加,但是发酵时间缩短了1h。经过综合分析,分批补料高密度发酵更适合于工业应用。
【作者】陈冠宇；
【导师】林建平；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】环氧化物水解酶；重组大肠杆菌；酒石酸；高密度发酵；

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