陆地棉ProDH基因的克隆、表达分析以及功能验证

陆地棉ProDH基因的克隆、表达分析以及功能验证

作者:师大云端图书馆 时间:2018-08-26 分类:硕士论文 喜欢:3662
师大云端图书馆

【摘要】脯氨酸是一种小分子的渗透物质,是水溶性最大的氨基酸,脯氨酸的积累能有效地应对渗透胁迫,它有稳定细胞的亚细胞结构以及清除自由基的作用,许多植物在受到逆境胁迫时都会积累高水平的脯氨酸。脯氨酸在植物正常生长发育中也起着重要的作用,许多植物组织或器官,特别是花、种子等生殖器官中有较高的脯氨酸含量。脯氨酸的积累依赖于其合成与降解两个过程。脯氨酸脱氢酶(ProDH)是脯氨酸降解过程中的关键酶,属黄素蛋白,存在于线粒体的内膜基质中。脯氨酸脱氢酶编码基因对环境胁迫十分敏感,脱水、极端温度等非生物胁迫都会抑制该基因的表达,并伴随脯氨酸的大量积累,将胁迫处理过的植株放到正常的生长环境下,该基因的表达迅速上调,参与脯氨酸的降解。为了研究棉花中该基因的功能,本研究通过同源克隆方法,从陆地棉苏棉22克隆出ProDH基因,验证了该基因的功能。对生长到3-4片真叶的苏棉22分两组进行处理,第一组样本进行盐胁迫处理后紧接着进行恢复处理;第二组外施脯氨酸处理。提取各个处理不同时间段的幼嫩叶片组织的RNA,通过荧光定量分析,来观察该基因的表达情况。构建35S:ProDH瞬时表达载体,进行亚细胞定位,观察该基因编码蛋白在细胞内的表达位点。构建了35S:ProDH超表达载体转化烟草,通过检测在正常生长条件以及盐胁迫处理下转基因烟草的生长情况,初步验证该基因的功能。构建了RNAi载体,为棉花转基因做好了准备。本研究的主要结果如下:1.以苏棉22幼嫩叶片为材料提取RNA,进行反转录,利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从陆地棉中克隆到脯氨酸脱氢酶编码基因的中间片段,用5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,通过设计全长引物得到一段全长为1633bp的cDNA序列,通过NCBI序列比对和生物学分析表明该片段包含一段完整的1548bpORF,共编码515个氨基酸,分子量为57.07KDa,等电点为:8.010009765625。同源序列比较发现,陆地棉脯氨酸脱氢酶的序列与葡萄、大豆、草莓等的脯氨酸脱氢酶氨基酸序列有较高的同源性,因此推断我们获得基因编码的产物是脯氨酸脱氢酶,该基因命名为ProDH。聚类分析也表明ProDH与毛果杨、葡萄、黄瓜等植物的ProDH的亲缘关系很近。蛋白质二级结构分析表明ProDH蛋白有α螺旋,β转角,延伸链以及随机卷曲结构。2.荧光定量PCR结果显示在盐处理1小时后,该基因表达上调,接着开始下调,到盐处理24小时后达到一个很低的水平,将处理过的棉花置于正常生长环境下,在恢复处理1小时后,该基因表达迅速上调,达到对照的40倍,随后开始下调,恢复至24小时时,达到对照水平。当施加浓度为0.1M的L-Proline时,该基因表达先是下调,在处理到6小时后表达量上升,第12小时达到最高水平,持续恢复至24小时后,该基因的表达达到对照水平。3.通过基因枪将该基因的瞬时表达载体轰击到洋葱表皮细胞中,对ProDH基因的表达产物进行亚细胞定位,结果发现该基因的表达产物定位于线粒体中。4.构建ProDH基因的过表达载体,用根癌农杆菌介导法转化烟草,对该基因进行初步的功能验证。通过对转基因烟草提取DNA,以及RNA,并用该基因的特异性引物进行PCR检测,获得了17棵转基因烟草植株,转化效率达到94%。对转基因烟草植株和野生型烟草植株进行干旱胁迫处理7天,发现转基因烟草抗旱能力明显减弱。5.构建了RNAi载体,通过PCR检测以及酶切验证,表明该载体构建成功。为下一步棉花转基因,获得耐盐棉花品种做好准备。通过以上试验,验证了克隆所得到的基因为陆地棉的脯氨酸脱氢酶(ProDH)编码基因,该基因编码脯氨酸降解过程中的关键酶,本研究为该基因的进一步研究以及耐盐棉花品种的培育提供了理论指导。
【作者】王富华;
【导师】唐灿明;
【作者基本信息】南京农业大学,作物遗传育种,2013,硕士
【关键词】陆地棉;ProDH基因;克隆;表达分析;功能验证;

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