不同序列的CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫效果的研究

【摘要】研究表明CpG-ODN是一种高效安全的疫苗佐剂,然而由于其相对较高的成本限制了其在禽类疫苗中的应用。本试验根据目前研究中表明的CpG-ODN的免疫活性与其序列结构特点的关系,以鸡阳性序列CpG-ODN2006为模板设计出几段CpG-ODN序列。然后通过体外和体内试验研究这几条CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫的增强效果,筛选出对鸡具有高效佐剂效果及低成本的CpG-ODN,并比较细菌来源的CpG-DNA和人工合成的CpG-ODN的佐剂效果。体外试验：研究不同序列的CpG-ODN对鸡脾脏淋巴细胞和鸡骨髓源树突状细胞的免疫刺激作用。体内试验：选取7日龄的雏鸡330只,随机分为11组。9日龄鼻腔免疫雏鸡；16日龄时,再进行二次免疫。第1-2组分别应用PBS和禽流感H5N1灭活病毒(IAIV)；第3-4组应用IAIV分别配合阳性序列CpG-ODNF1(30μg/鸡)和阴性序列CpG-ODNF2(30μg/鸡)；第5-7组应用IAIV分别配合不同剂量的CpG-ODNF3(10μg/鸡、30μg/鸡、80μg/鸡)；第8-10组应用IAIV分别配合不同序列的CpG-ODN(CpG-ODNF4、CpG-ODNF5、CpG-ODNF6)(30μg/鸡)；第11组应用IAIV配合细菌CpG-DNA(30μg／鸡)。首先通过检测鼻腔和气管中IL-6mRNA、IL-12mRNA和IFN-γmRNA的表达量来探讨不同序列的CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫局部细胞免疫水平的影响；通过检测鼻腔和气管涮洗液中禽流感特异性IgA的水平来探讨不同序列的CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫局部体液免疫水平的影响；通过检测血清中特异性IgG抗体及HI抗体的水平,来探讨不同序列的CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫全身免疫水平的影响；通过检测鼻腔和气管中TLR21mRNA的表达水平来进一步探讨不同序列的CpG-ODN对鸡的免疫刺激活性。结果如下：1不同序列的CpG-ODN对鸡脾脏淋巴细胞的刺激作用首先根据CpG-ODN的构效关系设计了4条CpG-ODN(试验中应用的6条CpG-ODN分别标号为F1,F2…F6)。应用WST-8CellCountingKit-8(CCK-8)检测各条CpG-ODN对鸡脾脏淋巴细胞的刺激作用。结果发现：各条CpG-ODN(除CpG-ODNF2外)及细菌CpG-DNA对鸡脾脏淋巴细胞的刺激指数极显著上升(P<0.01),但各条CpG-ODN(除CpG-ODNF2外)的刺激指数之间无显著差异(P>0.05)。其中CpG-ODNF1、CpG-ODNF3和CpG-ODNF6对鸡脾淋巴细胞的刺激指数较高,显著高于细菌CpG-DNA(P<0.05).本试验结果提示自行设计的几条CpG-ODN序列对鸡脾脏淋巴细胞有较好的免疫刺激活性。2不同序列的CpG-ODN对鸡骨髓源树突状细胞的刺激作用体外分离诱导培养出鸡骨髓源树突状细胞,分别经不同序列的CpG-ODN或经细菌CpG-DNA刺激培养24h后,应用流式细胞术检测鸡骨髓源树突状细胞表面成熟分子标志CD40和CD86表达量的变化。结果发现：经CpG-ODNF3刺激后的树突状细胞表面成熟分子标志CD40和CD86表达量的上调幅度最大。同时同种异体混合淋巴细胞反应的结果显示：经CpG-ODNF3刺激成熟的树突状细胞能显著诱导同种异体T细胞增殖(P<0.01),且经其刺激成熟的树突状细胞诱导同种异体T细胞增殖的能力最强。本试验结果提示自行设计的几条CpG-ODN序列能够活化并促进鸡骨髓源树突状细胞成熟,其中CpG-ODNF3刺激鸡骨髓源树突状细胞成熟的能力最强。3不同序列的CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫局部黏膜免疫的影响应用荧光定量PCR法检测各组鸡鼻腔和气管中IL-6mRNA、IL-12mRNA和IFN-ymRNA的表达量。结果发现：应用IAIV分别配合不同序列的CpG-ODN(除CpG-ODNF2外)和应用IAIV配合细菌CpG-DNA组,鸡鼻腔和气管中IL-6mRNA、IL-12mRNA和IFN-ymRNA的表达量均极显高于单独应用IAIV组(P<0.01)。其中应用IAIV分别配合CpG-ODNF1、CpG-ODNF3、CpG-ODNF6和细菌CpG-DNA组,鼻腔和气管中这三种细胞因子的表达量均较高。应用间接ELISA法检测各组鸡鼻腔和气管涮洗液中禽流感特异性IgA的水平。结果为：首免后第5周,各组鼻腔涮洗液中禽流感特异性IgA抗体水平最高,其中应用细菌CpG-DNA配合IAIV组,鼻腔涮洗液IgA抗体水平最高。其次是应用CpG-ODNF3配合IAIV组和应用CpG-ODNF1配合IAIV组,且这两组之间鼻腔涮洗液IgA抗体水平差异不显著(P>0.05)。首免后第3周,各组气管涮洗液中IgA抗体水平最高,其中应用IAIV配合细菌CpG-DNA组和应用IAIV配合CpG-ODNF3组气管涮洗液中IgA抗体水平最高,极显著高于应用IAIV配合CpG-ODNF1组(P<0.01)。不同剂量的CpG-ODNF3分别配合IAIV免疫雏鸡后,应用中等剂量(30μg/鸡)的CpG-ODNF3组,鼻腔和气管涮洗液中IgA抗体水平最高。以上两个试验显示自行设计的CpG-ODN(尤其是CpG-ODNF3)能有效增强禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫的呼吸道局部黏膜免疫反应。4不同序列的CpG-ODN对禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫全身免疫水平的影响通过血凝抑制(HI)试验检测各组血清中禽流感HI抗体水平。结果为：首免后第4周,各添加佐剂组血清中禽流感HI抗体水平达到峰值(应用CpG-ODNF4组HI抗体水平在首免后第3周达到峰值),其中应用IAIV分别配合细菌CpG-DNA、CpG-ODNF1、CpG-ODNF3组HI抗体水平分别为3、2.5、2.5。单独应用IAIV组HI抗体水平自首免第2周开始一直在1以下。应用间接ELISA的方法检测血清中禽流感特异性IgG抗体水平的变化。结果显示：首免7周内,应用IAIV分别配合不同序列的CpG-ODN(除CpG-ODNF2外)和应用IAIV配合细菌CpG-DNA组,血清中禽流感特异性IgG抗体水平均极显著高于单独应用IAIV组(P<0.01)。其中应用IAIV分别配合细菌CpG-DNA、CpG-ODNF3、CpG-ODNF6和CpG-ODNF1组,血清中禽流感特异性IgG抗体较高。不同剂量的CpG-ODNF3分别配合IAIV免疫雏鸡后,应用中等剂量(30μg/鸡)的CpG-ODNF3组,血清中HI抗体和禽流感特异性IgG抗体水平均最高。以上两个试验显示自行设计的CpG-ODN(尤其是CpG-ODNF3)能够在一定程度上增强禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫的全身免疫水平。5不同序列的CpG-ODN配合禽流感H5N1灭活病毒鼻腔免疫对鸡TLR21mRNA表达的影响应用荧光定量PCR法检测各组鸡鼻腔和气管中TLR21mRNA的表达水平。结果为：应用IAIV分别配合不同序列的CpG-ODN(除CpG-ODNF2外)和应用IAIV配合细菌CpG-DNA组,鼻腔和气管中TLR21mRNA的表达量均极显著高于单独应用IAIV组(P<0.01)。鼻腔中,应用IAIV配合CpG-ODNF3组TLR21mRNA的表达水平最高。气管中,应用IAIV分别配合CpG-ODNF3和CpG-DNA组TLR21mRNA的表达水平最高,但这两组之间,TLR21mRNA的表达水平无显著差异(P>0.05)。本试验表明自行设计的CpG-ODN能够活化并上调鸡TLR21mRNA的表达,其中CpG-ODNF3活化并上调TLR21mRNA表达的能力最强,甚至强于阳性序列CpG-ODNF1。
【作者】付佳；
【导师】杨倩；
【作者基本信息】南京农业大学，细胞生物学，2013，硕士
【关键词】CpG-ODN；禽流感H5N1灭活病毒；鼻腔免疫；TLR21；树突状细胞；

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