葡萄SnRK2基因家族的全基因组鉴定、表达分析及VvSnRK2.2基因的功能验证

【摘要】葡萄(VitisviniferaL.)是葡萄科葡萄属落叶藤本植物,是世界上广泛栽培的重要经济果树之一。随着社会的发展和人口的增多,环境日益恶化。干旱、盐渍化、高温、低温以及氧化胁迫等都严重影响植物的生长和发育,进而影响果树的产量和品质,因而提高植物的抗逆性成为当前农业研究的主要目标之一。SnRK2(蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2；Sucrosenon-fermenting1-relatedproteinkinases2),是植物体所特有的一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。研究表明,SnRK2家族成员在植物的生长和发育过程中起着重要的作用,包括细胞分化、植物代谢、细胞内的信号转录以及对干旱、极端温度和盐渍化等非生物胁迫的响应等。本论文的主要研究内容包括以下三个方面：1、运用生物信息学的方法,从全基因组水平上鉴定葡萄SnRK2家族成员基因,并对其系统发生、理化性质、二级结构、基因结构、motif、C末端序列和EST等方面进行预测和分析；2、利用基因芯片数据和荧光定量RT-PCR对葡萄SnRK2家族基因在组织/器官发育及不同生物/非生物胁迫处理条件下的表达模式进行了分析；3、在5BB中克隆了VvSnRK2.2基因,成功构建了过量表达载体,并利用花粉管通道法转化拟南芥,以进一步了解其功能。主要结果如下：1.利用隐马可夫模型(HMM)搜索和系统建树的方法,在葡萄中共鉴定出了6个VvSnRK2基因,并对其进行了理化性质、二级结构、基因结构、motif、C末端和EST等的预测和分析。结果表明,葡萄VvSnRK2家族为亲水性蛋白,二级结构主要以a-螺旋和不规则卷曲为主；在系谱发生上葡萄VvSnRK2s蛋白分为3个亚族；基因结构分析表明,葡萄中6个基因的外显子和内含子的分布非常保守,所有基因都含有9个外显子,并且除了VvSnRK2.3基因的内含子插入位点为1相位之外,所有基因内含子的插入位点都为O相位；motif和C末端序列分析表明,葡萄SnRK2基因家族具有较高的保守性；EST分析表明,6个基因在10个组织中呈不均匀分布,其中主要分布在果实、细胞悬浮物、叶片和花中。2.利用芯片数据分析了葡萄中6个SnRK2基因在组织/器官发育及生物/非生物胁迫处理条件下的表达模式。组织发育芯片数据表明,VvSnRK2s参与种子发育及果实的发育和衰老,并受到生物和非生物胁迫的诱导。在种子发育中,VvSnRK2.1.VvSnRK2.2和VvSnRK2.3主要表现为上调表达,VvSnRK2.5为下调表达。在果实发育和衰老过程中,多数VvSnRK2基因都表现为下调表达,且以VvSnRK2.5下调表达最为显著；在生物/非生物胁迫芯片数据分析中,VvSnRK2.6受白粉病和高温的诱导,而VvSnRK2.1受水分胁迫和盐的诱导；ABA的芯片数据分析结果与文献报道相一致,即第一亚家族不受ABA的诱导,第二亚家族受ABA的微弱诱导,第三亚家族受ABA的强烈诱导。3.为了进一步了解葡萄中6个SnRK2(VvSnRK2.1-VvSnRK2.6)基因的表达模式及功能,我们利用荧光定量RT-PCR的方法分析了这6个基因在ABA、干旱、NaCl、高温(45℃)和低温(4℃)等处理条件下的表达情况。结果表明,VvSnRK2.1在干旱和NaCl处理后显著上调表达,与芯片数据相一致；VvSnRK2.2和VvSnRK2.4受到高温的诱导；VvSnRK2.3受低温的诱导；VvSnRK2.1和VvSnRK2.5受ABA的显著诱导。4.为了进一步验证葡萄VvSnRK2家族基因的功能,我们从葡萄砧木5BB中克隆了VvSnRK2.2基因,构建了植物双元表达载体(35S:VvSnRK2.2),转化农杆菌,并利用花粉管通道法转化拟南芥,初步GUS染色获得了6个抗性株系,利用RT-PCR对2株抗性株系L34和L42进行了检测。以转基因拟南芥T3代种子和幼苗为材料,对转基因拟南芥进行了非生物胁迫抗性分析,结果表明,在ABA(10μM和50μM)处理培养基上,L34和L42转基因株系比野生型(WT)的反应更加敏感,且在对照(CK)和各种处理培养基上转基因拟南芥的叶片生长正常,而野生型(WT)叶片在ABA培养基上生长6天后表现为上翘(或向上卷曲),初步推测,该基因可能与气孔的运动或叶片组织结构有关系；通过植物抗旱性分析,证明VvSnRK2.2能够提高拟南芥对干旱的抗性,而在NaCl处理条件下,转基因株系比对照更加敏感。
【作者】陈娜娜；
【导师】程宗明；
【作者基本信息】南京农业大学，果树学，2013，硕士
【关键词】葡萄；VvSnRK2；生物信息学分析；RT-PCR；遗传转化；

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