颗粒细胞过表达FSHR对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

【摘要】自Mattioli等于1988年首次对猪卵母细胞体外成熟(IVM)研究以来,在许多研究人员的努力下,虽然猪卵母细胞IVM体系得到了较大的改进和优化,但是IVM效果依然较差。影响卵母细胞IVM效果的因素有许多,如：IVM基础培养液的成分；IVM培养液中的添加成分：激素及其浓度、细胞因子、卵泡液、抗氧化物质及维生素等；采取卵子的卵泡直径大小；卵母细胞周围包裹卵丘细胞的有无及数量多少；成熟培养时的温度、气相条件以及成熟培养时间等等。IVM过程中卵母细胞的核质成熟往往不同步,这也是导致IVM效果较差的关键因素之一。为了有效推动猪卵母细胞核质同步成熟,提高猪卵母细胞IVM效率,本研究在IVM中首次对颗粒细胞(GCs)FSH受体的过表达展开设计,采用带有新型荧光蛋白基因的慢病毒载体介导FSH受体基因转染GCs,实现FSH受体在GCs膜上长期、稳定的过表达。将卵母细胞与转染后的GCs共培养进行IVM,通过分析核质成熟的进程,阐明GCs膜上FSH受体过表达对猪卵母细胞核质成熟的调节机制,并以此来提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。本试验具体从以下几个方面进行了研究：1.猪FSHR基因的克隆及慢病毒表达载体CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus的构建Trizol试剂法提取猪卵巢组织总RNA,反转录cDNA并扩增猪FSHR基因。将FSHR基因首先连接到pMD19-T载体,然后运用不完全酶切法将FSHR基因酶切下来并连接到慢病毒载体CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus上,构建慢病毒重组表达载体CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus。2.猪卵泡颗粒细胞的体外分离纯化培养抽取猪卵巢上直径为2-6mm的卵泡内的卵泡液到一无菌的离心管,经过离心、0.2%透明质酸酶消化、PBS洗涤、0.25%胰酶消化等步骤后铺至细胞培养皿。待铺皿后第4天,颗粒细胞能完全铺满培养皿。经传代扩大培养一次后,将其在液氮内冻存备用。在实验过程中,我们成功分离纯化培养了猪原代卵泡颗粒细胞。所分离培养的颗粒细胞生长较旺盛,符合下步实验的要求。3.慢病毒的包装重组慢病毒表达载体穿梭质粒：CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus,包装质粒pCAG-HIVgp和包膜质粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev,三质粒用磷酸钙法共转染293T细胞,并在293T细胞内包装出具有感染力的慢病毒颗粒。取转染后的细胞悬液经过滤后,感染293T细胞,以此来检测包装出来的慢病毒感染效果。4.电穿孔法将重构载体CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus转染猪卵泡颗粒细胞,并将其与猪卵母细胞在体外共培养用电击法将重构慢病毒表达载体CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus转染猪卵泡颗粒细胞,将转染后的颗粒细胞与卵母细胞共培养,通过对卵子成熟后的第一极体排出率和受精后的卵裂率与对照组比较,阐明GCs膜上FSH受体过表达对猪卵母细胞核质成熟的调节机制。5.结果：FSH和LH在低浓度(0.01U/ml)时,实验组(转染CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus的颗粒细胞与卵母细胞共培养组)成熟卵母细胞第一极体排出率和卵裂率显著高于对照组(转染CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus的颗粒细胞共培养组和无颗粒细胞共培养组)。但在高浓度激素(0.1U/ml)时,实验组卵母细胞第一极体排出率及卵裂率低于对照组。另外,有颗粒细胞共培养组卵母细胞成熟率要高于无颗粒细胞共培养组。本实验为猪卵母细胞IVM探索了一种新的培养体系,旨在提高猪卵母细胞IVM过程中,其成熟发育率及其后的受精卵裂率。本研究的实施对卵母细胞IVM、胚胎工程、动物克隆及转基因动物生产都具有一定的促进推动作用。
【作者】杜江涛；
【导师】潘建治；石放雄；
【作者基本信息】南京农业大学，动物遗传育种与繁殖，2013，硕士
【关键词】猪卵母细胞；IVM；FSHR；慢病毒；颗粒细胞；

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