NJA-1菌中DON降解酶基因在毕赤酵母中的表达及其对DON降解效果分析

【摘要】脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)产生的单端孢霉烯族毒素。DON是一种全球性的谷物污染物,可引起人和动物的急性中毒,造成严重的经济损失。研究资料显示,单端孢霉烯毒素的12,13环氧环是主要的致毒基团,此环一旦遭到破坏,可以大大减少毒性。环氧化物水解酶(Epoxidehydrolase,EH)在催化反应中能显示出高的对映立体选择性,水解环氧化合物生成光学活性环氧化物和相应的1,2-二醇。研究发现,瘤胃及土壤中的一些微生物可以产生环氧化物水解酶,通过分解单端孢霉烯族毒素分子中的环氧基团,从而降低毒性。本实验室从土壤中分离获得一株NJA-1菌株,可以水解DON的环氧环。研究结果显示NJA-1菌中对DON的转化起到关键作用的是环氧化物水解酶。本试验在以前试验基础上,将已获得的DON降解酶基因与真核表达载体pPIC9K重组,构建pPIC9K-EHsq真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母GS115菌,进行诱导表达,利用高效液相色谱(HPLC)法研究表达产物转化DON的效果,从而证实该酶对DON具有转化作用。为该酶的大量发酵及体内转化DON打下基础。试验一：NJA-1菌中DON降解酶基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达本试验通过设计一对引物从已构建的pET32a(+)-EHse/BL21载体中扩增出EH基因,经NotI、EocRI双酶切连接至pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115中。根据甲醇利用表型进行初筛,利用G418筛选获得高拷贝重组酵母菌株,通过重组菌株的PCR检测鉴定,构建成真核表达载体pPIC9K-EHsq。利用甲醇诱导含有重组质粒pPIC9K-EHsq的酵母菌株,使其表达蛋白pEH。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析。试验结果表明,扩增出的EH基因片段成功插入pPIC9K中,真核表达载体pPIC9K-EHsq构建成功。SDS-PAGE表明EH基因在酵母中获得表达,目的蛋白主要以包涵体形式存在,其分子量约74.0kDa。试验二：pEH蛋白转化DON效果的检测及转化条件的优化本试验通过初酶液转化一定浓度的DON,利用HPLC检测反应后DON残余量,从而研究表达蛋白转化DON的效果。在此基础上通过改变温度、添加金属离子以及改变破壁方式进行转化条件的优化,研究了转化条件与转化效果的关系,从而获得优化的转化条件。试验结果表明,HPLC检测结果显示pEH能有效地转化DON。确定了pEH转化DON的优化条件,温度为27℃,通过超声破壁方式处理表达产物以及添加终浓度10mmol/L的Cu2+可以有效提高转化效率。
【作者】孟玲玲；
【导师】张海彬；
【作者基本信息】南京农业大学，临床兽医，2013，硕士
【关键词】EH基因；巴斯德毕赤酵母；真核表达载体；表达；DON；HPLC；

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