IHHN、WSS流行病学调查及IHHNV检测方法的建立

【摘要】随着各国对虾养殖业的蓬勃发展,在许多国家已经成为经济发展的支柱产业,但在对虾的养殖的过程中,存在对虾的高密度养殖,生态环境的不断恶化,对虾体质不断下降等问题,导致对虾养殖病的广泛流行,其中的对虾病毒病由于其发病迅速、传播速度快、死亡率高等原因,给养殖户造成了巨大的经济损失,成为阻碍对虾养殖产业发展的瓶颈。对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是感染对虾的两种重要的DNA病毒,具有世界暴发流行性,成为近几年对虾病毒研究的主攻课题。目前还没有针对IHHNV和WSSV的特效药,且对虾本身的免疫系统弱,给对虾IHHNV和WSSV的防治带来了巨大的困难,因此IHHNV及WSSV早期预防和培育抗病虾系显得尤为重要。本实验采用传统的PCR方法对江苏省的南京,南通,射阳新港、大丰以及厦门和江西南昌等部分养殖和市场对虾、克氏原鳌虾进行检测,所检测的494尾对虾的平均阳性率为37.5%,射阳新港和大丰养殖对虾的IHHNV携带率最高为100%,其次是厦门和南通,IHHNV阳性率分别为38.64%(17/44)和37.5%(12/32)。采集不同月份的对虾并进行检测,结果显示IHHNV高检出率集中在温度较高的6、7、8月份,这为早期预防IHHNV流行暴发提供了依据。由于采集的射阳养殖场对虾存在一定程度的躯体发红,个体小等症状,本实验扩增盐城射阳分离株的全基因序列,并进行基因分析构建系统发生树,进行亲缘性分析,结果显示,射阳株同非洲、越南、韩国分离株同源性较高,同江苏赣榆株的病毒序列有较大差异性,根据ORF1和ORF3构建的系统发生树的构建结果有一定差异。检测的494尾对虾中,WSSV的平均阳性检出率为36.84%,射阳新港养殖场和江苏大丰养殖场的对虾样品的WSSV阳性检出率均为100%,表明了WSSV与IHHNV存在共感染情况,检测的其他地区对虾样品的阳性率从高到低依次为江苏南通71.88%(23/32)、厦门34.09%(15/44)和卫岗市场22.70%(69/304),江西南昌的克氏原鳌虾的阳性检出率为2.5%(1/40)。WSSV检出率最高的月份集中在7、8、10月份,检出率分别为73.53%(25/34)、64.58%(31/48)和43.75%(7/16)。扩增射阳株和卫岗株的变异区序列,并构建系统发生树,结果显示射阳株同中国台湾分离株同源性最高为75.1%,而卫岗株同射阳株的同源性最高也仅为44.8%。荧光定量PCR方法作为一种新的方法,除了具有特异性好、敏感性高等优点,还能够对病毒进行定量。为更好地检测IHHNV的携带情况,更加准确地了解IHHNV流行情况,本实验建立了一种针对IHHNV保守区域大小为189bp的一段基因的荧光定量PCR检测方法,通过扩增不同浓度标准质粒、扩增不相关病毒基因、做重复实验进行敏感性、特异性和重复性分析,建立SYBRGreeI荧光定量PCR检测方法,所建立的检测方法最低能够检测1.2×102拷贝,与常规PCR相比具有灵敏度高的特点,扩增产物溶解曲线为单峰,且不扩增WSSV的基因、超纯水,显示出良好的特异性,重复性实验结果表明其变异系数在5%以内,本实验为IHHNV流行病学调查提供了新的检测方法。
【作者】徐文豪；
【导师】费荣梅；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医，2013，硕士
【关键词】IHHNV；WSSV；PCR；系统发生树；荧光定量PCR；

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