稻曲病菌T-DNA插入突变体A880-1、B1015侧翼相关基因的克隆及功能分析

【摘要】本研究基于启动子捕获技术,运用农杆菌介导转化法(AtMT)构建稻曲病菌突变体库,获得T-DNA插入突变体9800余株。其中A库中突变体个数为5600余株,其野生菌株为70-22；B库中突变体个数为4200余株,其野生菌株为P1。通过荧光显微观察,筛选获得T-DNA插入在稻曲病菌启动子下游区域的突变体10株。其中A库6株,分别为A880、A2000、A2331、A4829、A5248和A5297；B库4株,分别为B111、B367、B913和B4865。在这10株突变体的生长速率测定试验中,A880的纯化菌株A880-1和野生菌株70-22相比,在马铃薯蔗糖固体培养基(PSA)、TB3固体培养基和基本培养基(MM)中生长速率均变慢；在MM培养基中,A880-1中出现畸形菌丝,且在这些菌丝末端有大量的薄壁分生孢子长出,因此突变体A880-1用来做进一步的研究。在荧光显微镜下观察发现,突变体A880-1的菌丝与孢子都能被激发产生绿色荧光。利用聚合酶链式反应(PCR)技术证实了T-DNA插入在A880-1基因组中。经过Southern杂交分析证实了T-DNA在A880-1基因组中为单拷贝插入。运用高效的热不对称交错PCR(hi-TAILPCR)技术,克隆获得了T-DNA上gfp5’端上游,A880-1基因组DNA中2038bp大小的启动子序列,并将该启动子命名为puv880。将puv880在NCBI网站上进行比对,未发现存在同源性的序列。经过分析在puv880中找到启动子的核心元件TATA-box、CAAT-box以及几个其他可能的真核生物调控元件。同时在puv880发现三个类似于TATA-box的结构以及一个TATA-box的反向互补序列。依据5’缺失分析方法,选取puv880上靠近gfp一端长度分别为444bp、650bp、864bp和1045bp长的四段序列,和A880-1基因组中T-DNA一起扩增,然后将这四个片段在PEG的介导下转化到稻瘟病菌野生菌Guy11基因组中,结果表明所有的四个片段都表现出启动子活性。该实验结果证实了prv880的启动功能,同时证实puv880的核心启动子序列不超过444bp。结合生长速率测定,推测启动子puv880与稻曲病菌在不利环境下的生长与产孢有关,对解析稻曲病菌形成薄壁分生孢子的分子机理提供了重要线索。通过致病性试验,还获得一个稻曲病菌致病性丧失突变体B1015。与野生菌株P1相比,B1015在PSA、TB3及MM培养上生长速率明显变慢,在马铃薯蔗糖液体培养基(PS)上几乎没有生长,且没有分生孢子的产生,推测T-DNA的插入影响了稻曲病菌生长相关基因的功能。利用PCR技术证实了T-DNA插入在B1015的基因组中。经过Southern杂交分析证实T-DNA在B1015基因组中为单拷贝插入。采用hi-TAILPCR技术得到了T-DNA侧翼两端稻曲病菌突变体B1015上各247bp(U.vRB)和309bp(U.vLB)长的序列。依据U.vRB和U.vLB序列设计引物F1、R1,以突变体B1015基因组DNA为模板扩增后经测序发现T-DNA中gfp基因及其终止子的大部分序列丢失,推测T-DNA的插入导致了B1015中T-DNA部分序列的丢失。
【作者】胡建坤；
【导师】刘永锋；何健；
【作者基本信息】南京农业大学，微生物学，2013，硕士
【关键词】稻曲病菌；启动子；生长相关基因；生物学特性；克隆；

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