与兔出血症病毒相互作用的截短兔肝脏铁蛋白重链鉴定

【摘要】兔病毒性出血症(RabbitHemorrhagicDisease,RHD),俗称“兔瘟”,在中国的江苏地区首次爆发,兔出血症病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus,RHDV)属于兔病毒属中的嵌杯状病毒科(Calicivirus),(?)够引起兔的急性、高度接触性、败血性传染病,通常给养兔业带来毁灭性的伤害。肝脏是RHDV侵染的主要器官,与RHDV相互作用蛋白的研究是重点研究领域之一。本实验室前期通过SMART技术筛选和鉴定了与VP60相互作用的相关候选蛋白。铁蛋白重链(FerritinHeavyChain,FTH)是与VP60相互作用的候选蛋白之一,并利用GSTpulldown.ELISA.Co-IP及血凝试验等方法验证了FTH与RHDV具有相互作用。本研究对铁蛋白重链截短,进行体外表达,鉴定铁蛋白重链与RHDV相互作用的位点,为抗病毒药物的研制提供帮助。为精确定位兔铁蛋白重链与RHDV相互作用的位点,本研究提取兔肝脏组织总RNA,采用RT-PCR技术扩增FTH基因并分节段克隆于pGEX-6P-1载体中,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中经诱导表达目的蛋白,获得了5个FTH截短重组蛋白分别为rFl、rF2、rF3、rF4和rF5。通过ELISA试验以及血凝试验验证FTH截短重组蛋白与RHDV的相互作用。ELISA结果显示,重组蛋白rF4的OD450nm值为1.531,而重组蛋白rF1、rF2.rF3和rF5蛋白的OD450nm值分别为1.084、1.443、1.104、1.152,表明重组蛋白rF4可与RHDV存在相互作用,而重组蛋白rF1、rF2、rF3和rF5蛋白与RHDV不存在相互作用。血凝试验结果显示,3.1μg重组蛋白rF4可以中和8HAURHDV的血凝活性,实验组rF1、rF2、rF3和rF5均不能中和RHDV的血凝活性,表明RHDV仅与FTH截短重组蛋白rF4具有相互作用,FTH与RHDV相互作用的区域精确定位为F4段(80-123位氨基酸)。为了进一步验证感染、非感染兔肝脏组织差异蛋白及FTH截短重组蛋白与RHDV之间是否存在相互作用,应用了酵母双杂交技术进行鉴定。从兔肝脏组织提取总RNA,RHDV(HYD株)提取病毒RNA,反转录合成第一链cDNA,PCR扩增病毒的结构蛋白VP60、小结构蛋白VP10和7种非结构蛋白P16,P23,2C-likeprotein,P29,VPg,3C-likeprotease,RNA复制酶(RdRp)与49个差异蛋白及各节段FTH基因,分别与pGBKT7和pGADT7载体相连,构建酵母双杂交所用的诱饵载体pGBKT7-X和捕获载体pGADT7-Y,并对二者进行自激活活性和毒性检测,结果表明构建的pGADT7-Y和pGBKT7-X无自激活活性和毒性作用。将pGADT7-Y和pGBKT7-X共转化AH109酵母菌株,鉴定出2个阳性结果：VP60与延胡索酰乙酰乙酸酶存在相互作用,VP10与层粘连蛋白受体前体存在相互作用。本研究对FTH进行了截短表达,通过ELISA试验及血凝试验鉴定了铁蛋白重链F4段(80-123位氨基酸)与RHDV相互存在相互作用,为研发治疗用RHDV的短肽类药物提供了理论基础；利用酵母双杂交技术证明VP60与延胡索酰乙酰乙酸酶存在相互作用,VP10与层粘连蛋白受体前体存在相互作用,为进一步从蛋白质的水平研究和揭示RHDV感染机制奠定基础。
【作者】黄艳秋；
【导师】曲连东；崔玉东；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】兔病毒性出血症；兔铁蛋白重链；截短表达；相互作用；酵母双杂交；

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