结球白菜中抗寒基因的克隆及香菇表达载体的构建

【摘要】香菇(Lentinulaedodes)是在世界范围广泛种植的食用菌之一,但其中的一些高温型香菇在严寒的情况下的产量极低,香菇的这一性状严重地限制了香菇在低温下的生产。生产出抗寒性强和低温高产的新品种香菇是其生产和栽培工艺中急需解决的问题,随着基因工程技术的发展,抗寒基因克隆和转化的成功,为解决香菇抗寒这一难题提供了可能性。抗寒基因(Cold-regulated,COR)是诱导合成低温诱导蛋白的一种诱发基因,只有在特定条件(主要是低温和短日照)下才得以启动和表达。因此,如果利用分子生物学方法从抗寒的结球白菜中分离出有效的抗寒基因,并通过DNA重组与转基因技术等将这种特抗寒的基因克隆到高温型的香菇中,从而可以使香菇品种获得抗寒性,保证冬季高温香菇的持续供应。本研究克隆了COR基因,构建了含COR基因的香菇双元表达载体,通过根癌农杆菌将目的基因转移到香菇菌株内。主要研究结果如下：(1)构建了香菇表达载体,以CORR和CORF为引物,采用RT-PCR技术从结球白菜的mRNA中分离得到COR基因,然后以COR基因置换了质粒pcDNA3.1(+)-nptⅡ的nptⅡ基因,构建了适用于在食用菌中表达的COR基因表达盒PgpdA-COR-TtrpC;以质粒pDHt/sk-hyg为模版,将克隆得到得COR基因表达盒插入到该质粒中,构建了潮霉素抗性的双元载体pDHt/sk-hyg-COR。(2)建立了根癌农杆菌介导香菇遗传转化体系,采用了根癌农杆菌的转化方法,以香菇菌株武香一号(W1)的菌丝为受体,以pDHt/sk-hyg-COR为双元表达载体,成功实现了香菇菌株W1的遗传转化。结果表明：香菇菌株W1对潮霉素B敏感,50μg/ml能够完全抑制它的生长；转化效率比较低,不到7%,对转化子的PCR和southernblot检测表明,COR基因成功整合到香菇基因组中。遗传稳定性的实验结果表明,香菇转化子遗传稳定性好。这表明双元载体pDHt/sk-hyg-COR可以用于根癌农杆菌介导的遗传转化,COR基因也可以用于其他食用菌的遗传转化的研究。(3)优化了农杆菌和香菇菌株的共培养的条件,从农杆菌侵染的时间、共培养温度、以及在共培养过程中是否需要添加乙酰丁香酮等4个方面展开。结果表明,农杆菌的最佳侵染时间为20min；共培养最适温度为25℃；共培养1d和2d的转化效率区别不大；共培养期间添加乙酰丁香酮,对转化子的生长十分必要。
【作者】朱莉莎；
【导师】刘作易；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】香菇；COR；双元载体；结球白菜；共培养；遗传转化；

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