猪胸膜肺炎放线杆菌双组份调控系统PhoBR的功能研究

【摘要】猪传染性胸膜肺炎(PorcineContagiousPleuropneumonia,PCP),是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的传染性呼吸道疾病,在世界范围内对养猪业造成巨大损失。磷是病原菌一种重要的营养元素,在信号传导和能量代谢中起重要的作用。糖类作为碳源,对于细菌的生长有着至关重要的作用。在肺脏磷和碳源缺乏的情况下,有效均衡的生理反应和各种糖类的摄取利用,对于APP在猪呼吸道与肺脏中的生存定植具有非常重要的意义。病原菌在感染宿主的过程中,能通过双组份调控系统(Two-ComponentRegulatorySystem,TCS)密切感受和响应体内外各种微环境的变化,进而调节各种基因表达以完成其致病的过程。APP血清3型JL03的全基因组测序分析,表明APP具有5对完整的双组份调控系统：ArcA/B,CpxA/R,NarP/Q,PhoB/R,QseB/C。众多研究者对PhoBR双组份转导系统的研究表明：在磷限制培养条件下,PhoBR参与调控磷、糖的代谢和相关毒力因子的表达,但当前未见PhoBR在猪传染性胸膜肺炎中调控致病机制的研究。鉴于以上背景,本研究选用APP血清1型强毒力菌株SLW01作为亲本菌株,构建了SLW01的双基因缺失突变株AphoBR,同时构建了AphoBR基因缺失突变株的互补菌株C△phoBR。对突变株△phoBR进行了生物学特性和对小鼠致病力的研究,并在磷限制与正常培养情况下,通过Agilent单通道表达谱芯片和qRT-PCR,筛选突变株AphoBR与亲本株SLW01差异表达基因,初步探讨了PhoBR调控APP的可能致病机制。主要研究内容如下：1.双基因缺失突变株AphoBR与互补菌株CAphoBR的构建与鉴定。参考APP血清3型JL03的全基因组序列,设计引物,以APP血清1型SLW01基因组为模板,扩增phoB/R基因的上下游同源臂片段,将上下游片段分别连接到pEMD-18T载体上,酶切鉴定回收,连接到自杀性质粒pEMOC2,经酶切验证,成功构建了插入2272bp外源片段的重组质粒pEM-phoBR。测序表明,该外源片段与模板序列100%同源,将重组质粒pEM-phoBR转化至大肠杆菌p2155,作为供体菌与亲本株SLW01做接合转移,获得整合了pEM-phoBR重组质粒的单交换菌株,通过蔗糖负向筛选和氯霉素正向筛选,结合PCR鉴定,筛选出对氯霉素敏感,具有蔗糖抗性的克隆,进一步通过测序和荧光定量证实双基因缺失突变株△phoBR构建成功。参考APP血清3型JL03的全基因组序列,设计引物,以APP血清1型SLW01基因组为模板,扩增phoB/R基因片段,将该目的片段依次连接pEMD-18T、APP-E.coli穿梭质粒pJFF224-XN,构建重组表达质粒pJFF-phoBR,酶切、测序鉴定,该外源片段与phoB/R基因序列100%同源。将该重组质粒电转化至双基因缺失突变株AphoBR,经PCR和RT-PCR鉴定,证实互补菌株C△phoBR构建成功。2.突变株AphoBR生物学特性研究对突变株AphoBR进行生物学特性研究的结果表明：AphoBR可在体外稳定遗传；在正常培养条件下,突变株AphoBR体外增殖能力相比较野生株生长速率明显变慢,活菌数下降。在磷限制培养条件下,突变株AphoBR体外增殖能力与野生株SLW01基本一致；小鼠LD5o实验表明：突变株AphoBR木目比于亲本株SLW01和互补菌株C△phoBR毒力分别上升1.73倍和2.05倍(Korbor寇氏法)。小鼠存活率实验表明：相同感染剂量,突变株AphoBR组14只仅存活一只,存活率为7.14%。亲本株SLW01组最终14只存活6只,存活率42.86%,毒力差异显著；小鼠载菌量实验表明：在入侵与感染初期,突变株AphoB/R肺与血液中的载菌量显著高于野生株SLW01。随着感染时间的延长至120h,两者在肺组织中的菌量基本趋于一致,而在血液中的突变株的载菌量还维持在一个较高的水平；中性粒细胞杀伤实验表明,突变株AphoBR抵抗PMN杀伤能力相比于亲本株SLW01增强,差异极显著。以上结果表明,突变株AphoBR毒力相比于亲本株毒力上升。3.PhoBR调控机制的探讨对突变株AphoBR与亲本菌株SLW01差异表达基因进行分析,结果显示,在正常培养条件下,突变株AphoBR相比于亲本株SLW01上调表达2倍以上基因5个下调表达基因7个,这12个基因主要与糖类转运代谢先关；在磷限制培养条件下,突变株AphoBR相比于野生株SLW01上调表达2倍以上基因119个,下调表达2倍以上基因60个。这些基因主要与能量代谢、氨基酸转运和代谢、糖类的转运和代谢、辅酶代谢、转录后修饰,蛋白折叠和分子伴侣、无机铁的转运与代谢相关。进一步通过荧光定量PCR试验证实芯片结果可靠。PhoB/R可能通过调控毒力相关因子来影响APP的致病力。
【作者】王斌；
【导师】贝为成；陈焕春；金梅林；何启盖；周锐；蔡旭旺；谭臣；徐晓娟；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】胸膜肺炎放线杆菌；双组份调控系统；PhoB/R；

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