纽荷尔脐橙CsKO或CsKAO与CsCPR在毕赤酵母中共表达和表达产物功能研究

【摘要】贝壳杉烯氧化酶KO和贝壳杉烯酸氧化酶KAO是赤霉素生物合成过程中重要的限速酶,近几年来,越来越多的物种对这两种编码酶基因进行克隆和功能验证,如拟南芥、水稻、小立碗藓等,但柑橘中研究甚微。为了研究并验证柑橘中这两种酶功能,本研究分离了纽荷尔脐橙的内-贝壳杉烯氧化酶CsKO、内-贝壳杉烯酸氧化酶KAO和其自身的NADPH-细胞色素还原酶CsCPR,通过利用毕赤酵母X-33共表达的方式来验证这两种编码酶基因的功能。主要研究结果有：1.从纽荷尔脐橙成熟叶片中分离并克隆了纽荷尔脐橙NADPH细胞色素还原酶编码基因CsCPR,该基因CDS全长2148bp,编码715个氨基酸,预测分子量和等电点分别为79.2kDa和5.32,与可可和杨树CPR基因序列比对发现与它们的同源率可分别达到83%和82%。CsCPR可在NADPH存在条件下还原氧化型细胞色素C,使A550值发生改变。2.利用电转化和LiCl化学转化法获得了同一载体两种基因和不同抗性载体不同基因的双转化子,并对转化方法和阳性克隆选择方法进行了选择和优化,发现同种抗性载体的双转化子可以通过电转化方式获得,而不同抗性载体的双转化子需利用化学转化法获得。3.优化了毕赤酵母表达P450单氧化酶蛋白的表达条件,经过对不同表达条件下的蛋白总含量和微粒体中P450蛋白含量,得到在诱导表达4天、pH=5、甲醇浓度为0.75%是蛋白表达量最高,还对其它表达条件进行了正交实验分析,结果发现这些因素的对蛋白表达的影响力度：温度﹥BMGY:BMMY培养基置换比>YNB含量>甲醇浓度。4.用不同的底物与这两种酶反应,GC-MS分析反应产物验证它们的功能,结果发现共表达条件下,毕赤酵母双转化子中CsKO可以催化贝壳杉烯或贝壳杉烯醇到贝壳杉烯酸的氧化反应,这里的贝壳杉烯既可以使标准品也可以是日本柳杉挥发油中的贝壳杉烯。双转化子中的CsKAO也可以催化贝壳杉烯酸或GA12-醛到GA12的氧化反应。
【作者】王兴建；
【导师】伊华林；
【作者基本信息】华中农业大学，园艺学，2014，硕士
【关键词】纽荷尔脐橙；CsKO；CsKAO；CsCPR；毕赤酵母表达系统；P450；共表达；

【参考文献】
[1]王新.鹅源新城疫病毒的分离鉴定及灭活疫苗的制备和免疫程序的优化[D].吉林农业大学,兽医,2012,硕士.
[2]罗凌方.海峡两岸刑事鉴定制度比较研究[D].浙江大学,刑法学,2012,硕士.
[3]韩发,贲桂英,师生波.青藏高原不同海拔矮嵩草蛋白质、脂肪和淀粉含量的变异[J].植物生态学报,1997,02:2-9.
[4]柯怡文.国际大宗商品价格波动对我国通货膨胀的影响研究[D].华东师范大学,世界经济,2013,硕士.
[5]徐新黎,施莉娜,范丽霞,王万良.基于广义粗糙集的流程工业车间调度研究[J].控制与决策,2012,01:8-14.
[6]徐广贤.台湾电影字幕的语内翻译与语际翻译[D].福建师范大学,英语笔译（专业学位）,2013,硕士.
[7]罗春秋.基于维管束植物的碳纳米管及其复合纳米材料的制备与光催化性能研究[D].渤海大学,应用化学,2013,硕士.
[8]车红华.高等教育对地区经济的拉动作用研究[D].东北财经大学,统计学,2003,硕士.
[9]王璇.高速铁路车站视觉识别系统设计研究[D].南京师范大学,视觉传达设计,2012,硕士.
[10]唐妍.企业会计信息系统内部控制影响因素研究[D].辽宁大学,会计学,2012,硕士.
[11]李平.茶氨酸和茶氨酸合成酶活性的毛细管电泳检测及酶学研究[D].安徽农业大学,2005.
[12]郑烇,朱明,王俊普,蔡庆生.基于增量DFT的相似时序检索算法[J].控制与决策,2004,03:299-302.
[13]孙晓敏.77例脑膜癌病患者的回顾性分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[14]李钢,廖建辉,向奕霓.中国产业升级的方向与路径——中国第二产业占GDP的比例过高了吗[J].中国工业经济,2011,10:16-26.
[15]李佳喜.WZ30-25挖掘装载机挖掘工作装置仿真分析[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[16]陈雁.抗M3R抗体和IL-18在原发干燥综合征中作用的研究[D].厦门大学,药理学,2014,硕士.
[17]郑高海.常用抗菌药物对青蟹免疫指标的影响[D].宁波大学,渔业（专业学位）,2014,硕士.
[18]夏文学.中外二语教学实验研究比较分析[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[19]张莹荧.《铁路自动站间闭塞技术条件》行业标准[J].铁道通信信号.2004(08)
[20]张妍妍.法国华文报刊研究[D].中央民族大学,新闻学,2004,硕士.
[21]江青松.民营企业预防资金链断裂策略研究[D].南京农业大学,工商管理,2013,硕士.
[22]王娟.产乙酸微生物的分离、诱变及产酸性能研究[D].内蒙古工业大学,环境工程,2013,硕士.
[23]李杏娟.湘钢宽厚板MES的应用[J].冶金自动化,2011,01:60.
[24]魏艳芳.基于公允价值计量的企业价值评估方法研究[D].兰州理工大学,会计学,2012,硕士.
[25]印静.OWL本体图形化建模的布图算法的研究与实现[D].华南理工大学,软件工程,2012,硕士.
[26]张军晖.气体火花开关放电动态仿真及实验研究[D].南京农业大学,农业电气化与自动化,2013,硕士.
[27]王春丽.保定市保华调味品有限公司口译实践报告[D].河北大学,日语口译,2014,硕士.
[28]彭福州.云南后谷咖啡公司发展战略研究[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[29]许少鹏.湖南民办职业培训机构发展战略研究[D].湖南大学,工商管理,2003,硕士.
[30]白永明.澄合矿业公司全面风险管理研究[D].西安科技大学,工商管理,2014,硕士.
[31]杨志魁.基于灵敏度有效独立的传感器优化布置研究[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[32]赵淑杰.1961-1963年北京市精简职工政策的回顾与思考[D].中共中央党校,中共党史,2013,硕士.
[33]李小华.钼靶X线立体定位在乳腺隐匿性病灶中的应用[D].苏州大学,普外科（专业学位）,2013,硕士.
[34]芮亚慧.英汉礼貌用语研究与礼貌用语教学[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[35]韦人道.越南中小企业劳动力就业现状与发展对策研究[D].吉林大学,企业管理,2013,硕士.
[36]王迪.北京城市轨道交通广告传媒资产市场化运作模式结果评价及对策研究[D].北京交通大学,2014.
[37]孙瑞敏.对建筑学专业美术教学的探讨[D].内蒙古师范大学,美术学（专业学位）,2012,硕士.
[38]俞华英.薄壁塑件注塑成型的数值模拟和成型工艺参数优化的研究[D].浙江工业大学,2008.
[39]岳崑.试论水彩风景画的情境表达[D].沈阳师范大学,美术,2014,硕士.
[40]刘学.伺服液压缸试验台系统的分析与控制特性研究[D].沈阳工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[41]张黎明.警用GPS应用系统关键技术研究[D].天津大学,警用地理信息应用,2013,硕士.
[42]刘续承.中国行政管理现代化研究[D].首都经济贸易大学,行政管理,2013,硕士.
[43]聂瑞兴.时滞混沌神经网络的采样同步研究[D].太原科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[44]上官松.基于Web的ASIP集成设计环境研究[D].武汉纺织大学,物理电子学,2013,硕士.
[45]余利群.介质阻挡放电温度特性及活性物质光谱诊断研究[D].浙江大学,工程热物理,2013,硕士.
[46]陈建勋,姜久纯,王梦恕.黄土隧道网喷支护结构中锚杆的作用[J].中国公路学报,2007,03:71-75.
[47]张妙飞.煤矿通信联络系统语音网关的设计[D].中国矿业大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[48]张捷俊.微带天线的RCS缩减技术研究[D].北京交通大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[49]梁宝莹.近五年珠三角地区RGH女性患者生育及药物干预情况调查[D].广州中医药大学,中医外科学（专业学位）,2013,硕士.
[50]沈铠.基于ANSYS的漏磁信号特征有限元数值分析[D].北京交通大学,2013.