纳米铜对猪肾细胞线粒体凋亡途径的影响

【摘要】纳米铜作为纳米科技迅猛发展的重要成果,越来越广泛的应用于养殖业、饲料行业等畜牧兽医相关领域。在畜牧业中,铜作为一种促生长剂被广泛的使用,但传统的铜添加剂吸收利用率低,大量铜随粪便排出,污染了土壤环境的同时也造成了极大的浪费。而使用纳米铜作为饲料添加剂可显著提高表观消化率、提高生产性能和机体免疫力。但伴随着纳米铜高利用率和效能而来的生物安全性问题也逐渐凸显出来。研究表明,纳米铜的主要靶器官是肾脏和肝脏,反复经口染毒可引起肾脏和肝脏的损伤；离体实验显示,培养基中添加过量的纳米铜可以诱导细胞形态学的变化和细胞器的损伤,同时纳米铜还可以剂量依赖性的诱导细胞的凋亡,并在此过程中伴随着线粒体膜电位的改变,线粒体膜电位的改变被看成是细胞凋亡线粒体途径(内源性途径)的起始事件,但关于纳米铜与线粒体途径凋亡关系的更进一步研究尚未发现报道。本实验就以猪的肾上皮细胞作为实验材料,进行20、40、60、80μg/mL四种不同剂量纳米铜的染毒处理,通过对猪肾上皮细胞的形态学变化、凋亡率、线粒体膜电位的变化以及细胞内Bid、Bax、Caspase-3和细胞色素C的mRNA表达变化情况的观察,探讨了纳米铜和细胞凋亡的剂量效应关系,以阐述纳米铜对细胞凋亡中线粒体途径的影响。实验结果显示：1.应用HE染色、AO/EB双荧光染色,观察纳米铜对肾上皮细胞的诱导凋亡作用,可以观察到细胞收缩变圆,细胞间距增大。从形态学角度证实纳米铜能够引发肾上皮细胞的凋亡,且肾上皮细胞的凋亡指数与培养基中添加的纳米铜剂量呈正相关。2.应用FITC-PI染色法,使用流式细胞术观察纳米铜对肾上皮细胞凋亡率的影响,结果显示四组细胞的总凋亡率分别为16.77%、17.04%、25.93%、30.25%。表明培养基中添加不同浓度的培养基均能使细胞的凋亡率上升,且肾上皮细胞的凋亡率与培养基中添加的纳米铜呈正相关,证实了在培养基中添加纳米铜能诱导细胞的凋亡。3.使用JC染色法,用流式细胞仪检测肾上皮细胞线粒体膜电位的变化情况,结果显示培养基中添加四种不同浓度的纳米铜引起细胞线粒体膜电位变化的百分率分别为8.72%、10.14%、28.43%、57.44%,证实了纳米铜确实可以引起线粒体膜电位的变化从而影响细胞的线粒体凋亡途径。4.应用荧光定量PCR技术,检测在添加纳米铜后3、6、12、24h四个时间段和20、40、60、80μg/mL四种不同浓度的纳米铜对细胞线粒体凋亡途径中关键蛋白Bid、Bax、caspase-3以及细胞色素C的mRNA表达量变化。实验结果显示,Bid和Bax基因在40到60μg/mL浓度区间时表达量达到峰值,并且有随着时间延长峰值有前移的趋势,揭示了在此浓度区间内,Bid与Bax大量生成并共同作用在线粒体膜上,增大了线粒体膜对于细胞色素C的通透性。细胞色素CmRNA的表达量在3、6h组中的表达量随浓度的增加而增加,在60μg/mL浓度时达到最大而在最高浓度80μg/mL时略微下降；在12、24h组中,峰值前移在40μg/mL浓度时就达到最大。Caspase-3的mRNA受时间影响不大都是在40μg/mL浓度时达到峰值。本实验从细胞凋亡、线粒体膜电位的变化以及线粒体凋亡途径中的关键蛋白基因表达量的角度入手,探讨了纳米铜对于细胞凋亡线粒体途径的影响,为揭示纳米铜诱发细胞凋亡的机制提供实验依据,也为进一步研究纳米铜对生物的影响提供了新的思路,并为保护环境和合理使用纳米铜饲料添加剂提供科学的依据。
【作者】李朝阳；
【导师】周东海；
【作者基本信息】华中农业大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】纳米铜；猪肾上皮细胞；线粒体凋亡途径；凋亡相关基因；

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