观赏花烟草（Nicotiana sanderae）VIGS体系构建与优化

【摘要】观赏花烟草(Nicotianasanderae)是茄科烟草属福吉特氏烟草(Nicotianaforgetiana)和花烟草(.Nicotianaalata)的杂交种,花色艳丽且具有香味,十分适合进行花色花香基因功能的研究。为了搭建起大规模验证观赏花烟草新型花色花香基因功能的技术平台,我们利用由烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)构建而来的重组病毒载体,以八氢番茄红素脱氢酶(Phytoenedesaturase,PDS)基因和查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)基因为报告基因,进行了观赏花烟草病毒诱导基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)体系的初步构建与优化,结果如下：1、以PDS基因作为报告基因的试验中,用根吸收法侵染观赏花烟草浸种催芽至0.5-1cm长的幼根,种子点播后成活率均低于30%,且成活的样本在其整个生命周期内均未出现过叶片光漂白的预期现象,证明根吸收法并不适用于诱导观赏花烟草的基因沉默；而常规播种养护至观赏花烟草五叶期或六叶期再使用扩大培养浓度为OD600=1.1的农杆菌菌液制备侵染液,用叶背注射渗透法(注射器不带针头)向最内轮叶片叶背打入200-400μ1侵染液进行叶片侵染,此后将植株置于光照培养箱中,先设定16h为25℃、8h为18℃在全黑暗条件下培养1天,再设定光温周期为光照16h25℃/黑暗8h18℃进行常规养护,25天后处理组中表现出预期叶片光漂白现象的植株占到80%;2、利用”siRNAScan”筛选出能有效产生21ntsiRNA的CHS基因片段,用不依赖连接的克隆(Ligation-Independentcloning,LIC)法构建重组病毒载体pTRV2-CHS,检测阳性率达100%；3、以CHS基因作为报告基因的试验中,采用前述VIGS技术体系进行叶片侵染及培养,注射侵染30天后或45天后(此时已入秋,气温不高于28℃)将植株从光照培养箱移至夜间加光3h的温室大棚中,常规养护,植株开花后成功表现出预期花冠褪红斑白现象的植株占到60%,RT-PCR检验CHS基因确有下调；而进行生长点侵染的处理组植株均未获得预期表型。
【作者】张茜；
【导师】王彩云；刘国峰；张俊卫；胡惠蓉；宁国贵；刘秀群；
【作者基本信息】华中农业大学，园林植物与观赏园艺，2014，硕士
【关键词】观赏花烟草；病毒诱导的基因沉默；烟草脆裂病毒；不依赖连接的克隆；花色花香；

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