Sirtuins与肝细胞癌预后及浸润性γδT细胞功能缺陷的关系研究

【摘要】原发性肝癌是危害我国人民健康的常见恶性肿瘤之一,在西方国家的发病率近年来呈增高趋势。全球每年60多万人死于肝癌,其中50%发生在中国。如今临床上手术治疗仍然是治疗肝癌的主要手段,但术后较高的转移复发率成为提高肝癌远期疗效的主要障碍。为了解决这一棘手难题,很多研究从肝癌细胞的角度出发,发现了众多与肝细胞癌发生发展以及转移的基因,并且针对这些靶点进行抗肿瘤治疗,但遗憾的是均未达到理想的干预效果。近年来,肿瘤微环境日益备受关注,从这个角度出发研究各种免疫干预手段,尝试调整或改变肿瘤免疫反应状态,以期发现干预肿瘤发生发展的有效途径[1]。目前,虽然很多针对免疫微环境的机制尚未阐明,然而已经出现肝细胞癌患者对局部免疫反应的有效应答,并且改善了临床疾病进展程度,有的方法甚至提高了患者的生存率[2]。T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中的重要组成成员。T淋巴细胞大体上可以分为αpT细胞(T细胞受体双肽链由α链及β链构成)和γδT细胞(T细胞受体双肽链则由γ链及6链构成)。前者主要包括细胞毒性T细胞、NKT细胞(NaturekillTcells;NKTcells)、辅助性T细胞(Th1、Th2、Th17、Treg细胞),由于其数量和分布优势备受关注,免疫效应的研究也不断深入[3-5]。后者则由于分布局限(外周血中所占比例不超过成熟T细胞总数的10%),认识程度不足。但是近来发现γδT细胞在肝脏中特殊富集,局部浸润数目可达T细胞总数的35%,并且在肝脏中发挥了不可忽视的免疫监视作用[6]。γ5T细胞是一组较为特殊的T细胞亚群,兼有固有免疫和特异性免疫双重特征,具有杀伤和调节双重功能,在局部免疫稳态的维持上发挥着关键作用[7]。概括地讲,首先由于T细胞受体多态性有限,能激活不依赖抗原递呈细胞,而且不受主要组织相容性抗原限制,是固有免疫的重要组成部分；次之,本身能发挥抗原递呈作用,为幼稚型αβT细胞的增殖、分化及活化提供共刺激信号,从而介导特异性免疫的诱导、活化[8];另外动物实验中亦表明γδT细胞可通过直接杀瘤作用、早期大量分泌IFN-y及抑制αβT细胞中的促癌细胞成分来抑制肿瘤的发生与进展[9]。此外,体外实验也证实γδT细胞能以T细胞受体(Tcellreceptor;TCR)依赖／非依赖方式杀伤多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞,并且磷酸化抗原能有效地刺激γδδT细胞增殖与活化,增强其杀伤肿瘤细胞的效率[10-14]。这些证据表明γδT细胞在组织中可发挥免疫调节作用。针对这群亚群细胞——γδT细胞在肿瘤微环境的角色及作用特点,我们前期研究了γδT细胞在肝细胞癌中的免疫状态及与其他免疫细胞间的相互作用。发现γδδT细胞在外周血中比例较低,但在肝脏中大量浸润,而肝细胞癌中浸润却较癌旁肝组织中明显降低；肝细胞癌浸润性γδT细胞表现为功能抑制表型、激活性受体(NKG2D)表达下调、体外非特异性及特异性杀伤功能均明显减弱；肝细胞癌内γδT细胞与调节性T细胞(RegulatoryTcells;Treg细胞)间明显负相关,Treg细胞通过转化生长因子p、白介素10依赖途径抑制γδT细胞的杀伤功能[15]。目前虽然对γδT细胞的角色认识不断深入,但对于γδT细胞对肝细胞癌患者的预后价值尚未阐明；肝细胞癌浸润性γδT细胞功能减弱的内在机制尚不明确,有待进一步的研究。很多研究发现组蛋白去乙酰化家族(Histonedeacetylases;HDACs)抑制剂可以促进肿瘤细胞表达主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilityantigen;MHC)表型Ⅰ-相关性A链和B链(MHCclassI-relatedchainAandB;MICA/B),使得肿瘤细胞易于被NK细胞识别并杀伤,这一杀伤过程主要通过NKG2D来介导实现[16]。体内实验亦发现通过对鼠类行HDAC抑制剂干预,可对肿瘤起到抑制的作用[17]。令我们感兴趣的是,NKG2D主要表达在自然杀伤细胞,CD8+T细胞和γδδT细胞上,在肿瘤抗原识别、肿瘤细胞杀伤中发挥重要作用[18]。我们前期研究亦表明该受体在肝癌浸润性γδT细胞中表达明显下调[15]。这提示HDACs抑制剂可能参与了肝细胞癌浸润性γδT细胞功能减弱,具体的机制值得进一步研究。表观遗传修饰在调节基因表达、生命周期和肿瘤形成方面都发挥重要作用[19]。其中,乙酰化修饰对于调节细胞许多生物功能起着关键作用[20-21]。HDACs包括四大类,其中第三类为Sirtuins,与其他家族成员不同的是,它们是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adeninedinucleotide,NAD)依赖性的,不能被其他类成员抑制剂所抑制[21]。它的生物活性由[NAD+]/[NADH]比值所决定,具体而言,[NAD+]是激活剂,[NADH]是抑制剂。Sirtuins是广泛表达在生物界的一个家族,小到细菌,大到人类均存在表达,是酵母沉默调节因子2(yeastsilentinformationregulator2;Sir2)的异构体。Sirtuins的效应目标亦包括众多非组蛋白,没有一定的特异性和选择性,反应形式主要表现为去乙酰化和ADP-核糖基化[22]。两种反应形式均以NAD+的裂解为起始反应,两者不同之处在于Sirtl,Sirt2,Sirt3,Sirt5,Sirt7对目的蛋白赖氨酸残端进行去乙酰化,以NAD+作为辅因子,反应结果是释放一分子尼克酰胺和一分子2’-O-乙酰基-ADP核糖。与此相反的是,Sirt4和Sirt6进行的是ADP-核糖基化反应,反应结果是将底物行ADP核糖基化[22]。近年来Sirtuins越来越备受关注,发现其在众多生物过程中充当重要角色,包括调节细胞代谢,调控细胞增殖和生存,耐受应激和凋亡。Sirtuins在代谢类疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症性疾病,尤其是肿瘤中均扮演重要的角色[21]。Sirtl作为Sir2最同源性结构的成员,在急性髓性白血病、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胶质瘤、非恶性皮肤瘤中发挥作用。但是Sirtl因不同类型肿瘤,不同肿瘤发展阶段而扮演不同的角色,存在促癌和抑癌两面性[23-24]。同样,其他Sirtuins成员在乳腺癌、胰腺癌等研究中发现亦与肿瘤的发生发展有着密不可分的关系[25-26]。因此对于肿瘤中表达失控的Sirtuins成员,利用Sirtuins抑制剂可能对肿瘤的发生发展起到一定的抑制作用,具有较为明显的临床意义。但目前对于Sirtuins在肝细胞癌中的表达特点以及与肝癌的生物学特性关系尚未阐明。本课题以肝细胞癌为主要研究对象：一、从γδT细胞入手,前期工作发现,γδT细胞在外周血中比例较低,但在肝脏中大量浸润,而肝细胞癌中浸润却较癌旁肝组织中明显降低；肝细胞癌浸润性γδT细胞表现为功能抑制表型、杀伤功能明显减弱；肝细胞癌内γδT细胞与Treg细胞间明显负相关,Treg细胞通过转化生长因子p(transforminggrowthfactorβ,TGFP)、白介素10(Interleukin10;IL-10)依赖途径抑制γδT细胞的杀伤功能[15]。本课题我们利用组织芯片(TissueMicroarray;TMA)行γδT细胞免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC),进行绝对计数,探讨了γδT细胞在肝癌组织中的分布及与肝癌患者预后的关系。发现癌旁γδT细胞的数量与肝癌患者术后复发息息相关；二、利用肝癌患者的癌组织与癌旁组织,对γδT细胞的功能性指标与Sirtuins家族表达量进行相关性分析,探讨两者之间相互作用的分子机制。发现癌中γδT细胞表达的NKG2D,穿孔素与Sirtuins家族中Sirt3的表达水平密切相关。三、从HDACs调控表观遗传学修饰出发,利用组织芯片免疫组织化学染色,及冻存肝癌及癌旁组织免疫印迹(Westernblotting,WB)分析,探讨内源性Sirtuins在塑造肝细胞癌中的作用。我们发现肝细胞癌表达的Sirt3与肝癌预后相关,并且在早期肝癌患者中的预后价值最大。四、利用慢病毒过表达转染肝癌细胞株,在细胞增殖、细胞凋亡、迁移和侵袭等方面,探讨了Sirt3在肝癌发生发展中充当的角色。发现Sirt3在抑制肝癌细胞增殖、促进肿瘤凋亡,抑制肿瘤迁移和侵袭方面均发挥相应作用。第一部分yδT细胞在肝细胞癌患者的预后价值本研究旨在通过探讨γδT细胞在肝癌及癌旁组织中的表达情况及与肝癌生物学特性的相关性,研究γδT细胞在肝细胞癌中的预后价值。通过对大样本肝细胞癌建立的组织芯片行免疫组织化学染色,对癌及癌旁γδT细胞分别进行绝对计数,通过“最小P值法”得到最佳界值个数。统计分析yδT细胞在肝细胞癌患者肝癌组织,癌旁组织中的表达,可得到γδT细胞浸润数目与肝癌预后及临床病理特征间的关系。结果发现,癌组织中γδT细胞浸润明显减少,癌旁γδT细胞浸润数量增多。癌与癌旁组织γδT细胞与肿瘤的大小呈明显相关性(癌,P=0.022;癌旁,P=0.005)。通过单因素分析,癌旁γδT细胞浸润个数减少与肝癌术后复发和总体生存率呈明显相关性(TTR,P=0.010；OS,P=0.036)；通过多因素分析,癌旁yδT细胞浸润与肝细胞癌术后复发明显相关,总体生存率无明显相关(TTR,P=0.014:OS,P=0.279).另对癌旁γδT细胞进行多因素分层分析得到在BCLC早期肝癌患者术后复发中具有明显预后价值(TTR,P=0.038:OS,P:0.231).此外癌组织中γδT细胞仅在单因素分析后与总体生存率相关(TTR,P=0.599:OS,P=0.038).癌旁γδT细胞的浸润与肝细胞癌患者术后复发密切相关,这也提示癌旁也是导致术后复发的主要因素之一,也提示γδT细胞可作为肝癌免疫治疗,作为预防肝癌术后复发的重要手段之一。第二部分γδT细胞功能性指标与Sirtuins家族表达的相关性研究本研究旨在通过对γδT细胞功能性指标与Sirtuins家族表达的相关性研究,探讨Sirtuins家族对肝癌中γδT细胞浸润减少与功能缺陷的影响。通过利用13例患者的新鲜癌及癌旁组织,分离并纯化γδT细胞,利用流式细胞仪分析γδT细胞的功能表型(包括NKG2D表达、Perforin及GranzymeB表达、γ干扰素(Interferon-γ;IFN-γ)表达),采用WB检测Sirtuins家族蛋白表达水平,然后进行相关性统计分析,以期发现两者间的相关性,为进一步研究提供指导。结果发现Sirtuins中的Sirt3的表达水平与癌yδT细胞的功能性指标NKG2D及穿孔素具有明显的相关性,统计数据具有统计学意义(NKG2D,P=0.0024:穿孔素,P=0.020)。这提示Sirt3可能在一定程度上参与了癌组织中γδT细胞功能受损,值得进一步研究。第三部分Sirtuins的表达与肝细胞癌患者预后的相关研究本研究旨在通过明确Sirtuins家族成员在肝细胞癌及癌旁的表达情况及与肝癌生物学特性的相关性,探讨Sirtuins在肝细胞癌中的预后价值。Sirtuins家族包括七个成员,是在生物体中广泛存在并高度保守表达的一组蛋白,主要对靶蛋白进行去乙酰化,参与细胞周期,细胞分裂,转录调节和机体代谢等重要功能。研究提示Sirtuins家族在维持基因表达的稳定性和延长生命周期方面均发挥关键作用。近来发现Sirtuins在肿瘤的发生发展中亦扮演重要角色。Sirt3是Sirtuins家族中的一员,主要定位于线粒体,已经发现在多种肿瘤中异常表达,但在肝细胞癌中的表达情况及预后价值不甚清楚。我们拟通过免疫组化及免疫印迹,分析Siruins在肝癌及癌旁组织中的表达情况,得到Siruins与肝癌预后及临床病理特征间的关系。IHC与WB结果均表明Sirt3在癌组织中的表达明显低于癌旁组织(IHC:P=0.003:WB:P=0.0042).多因素分析后,癌组织中的Sirt3低表达与肝细胞癌术后复发及肝癌患者总体生存率密切相关(TTR,P=0.031:OS,P=0.001),并且在BCLC早期患者中亦具有预后价值(TTR,P=0.011；OS,P<0.001).此外,经多因素分析后Sirt3在癌旁中的低表达亦与肝细胞癌的不良预后相关(TTR,P=0.047；OS,P=0.031).Sirtuins家族其他六个成员未表现出显著的肝癌预后价值。本研究表明癌与癌旁Sirt3可作为肝细胞癌术后患者不良预后的有效指标,并在BCLC早期患者中具有预后价值,并可指导临床医生为患者制定更为合理的治疗方案。第四部分Sirt3在肝细胞癌中的功能研究本研究旨在建立慢病毒转染过表达Sirt3肝癌细胞株,并且通过细胞功能试验来阐述Sirt3如何对肝细胞癌的预后产生影响。Sirt3是Sirtuins家族中的重要成员,主要定位于线粒体,在细胞代谢中发挥着关键作用,近来发现Sirt3亦参与肿瘤细胞的代谢调节。我们通过组织芯片发现Sirt3在肝癌中表达明显下调,且具有明显的预后价值,能够影响肝细胞癌术后复发和总体生存率。本部分我们则通过绿色荧光蛋白(GFP)耦联的慢病毒转染肝癌细胞株,得到稳转细胞系。通过细胞凋亡试验,细胞增殖试验,划痕试验,迁移和侵袭试验来探讨Sirt3如何影响肝细胞癌发生发展的分子机制。通过TUNEL细胞凋亡试验发现过表达的肝癌细胞株能够一定程度上促进肝癌细胞凋亡。CCK-8细胞增殖试验提示过表达Sirt3细胞株(SMMC7721)能够抑制肝癌细胞的数量增多；划痕试验和Transwell细胞迁移试验提示过表达Sirt3可以一定程度上抑制肝癌细胞迁移：Transwell细胞侵袭试验提示过表达Sirt3可以一定程度上抑制肝癌细胞的侵袭能力。过表达Sirt3可促进SMMC7721细胞凋亡,一定程度上抑制SMMC7721细胞体外增殖、迁移和侵袭的能力。结论1.通过多因素生存分析,肝细胞癌旁γδT浸润与肝细胞癌术后复发呈负相关。2.通过相关性分析,肝细胞癌中γδT表达的功能性指标NKG2D和穿孔素与癌Sirt3的表达具有明显相关性。3.通过多因素生存分析,肝细胞癌及癌旁Sirt3表达与肝细胞癌术后复发及总体生存率相关,且癌中Sirt3表达与BCLCA期患者预后相关。4.通过肝癌细胞株体外功能实验发现,Sirt3在促进细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖,抑制肿瘤迁移和侵袭方面均发挥一定作用。创新点1首次明确γδT细胞在肝癌及癌旁组织中的预后价值。2首次证实肝癌及癌旁中Sirt3的表达与肝细胞癌预后的关系。3首次通过体外实验证实Sirt3对肝细胞癌预后影响的功能途径。
【作者】王嘉兴；
【导师】邱双健；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肝细胞癌；微环境；γδT细胞；Sirtuins；预后；

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