Shewanella algae和Arthrobacter nicotianae中丝氨酸羟甲基转移酶酶学性质的分析、定向进化及应用

【摘要】L-丝氨酸因其具有重要的生理功能及其生化作用而在化工、制药、食品以及化妆品生产等多个行业中有着十分广泛的应用。以甘氨酸和甲醇作为底物,借助于甲基营养型细菌体内的丝氨酸循环途径生产丝氨酸的方法已经有很多报道,但目前研究报道的细菌都来自于陆地环境。当前酶促转化法是L-丝氨酸的主要生产方法,丝氨酸羟甲基转移酶(serinehydroxymethyltransferase,SHMT;E.C.2.1.2.1)是酶促转化过程中的关键酶,所以,发现和分离一些高产丝氨酸活性的水生细菌显得非常重要。本研究中,具有高活性SHMT的细菌Shewanellaalgae(S.algae)和Arthrobacternicotianae(A.nicotianae),分别来自于海洋淤泥和南湖淡水环境中筛选出来。与L-丝氨酸合成相关的酶为SHMT,由glyA基因编码,通过TAIL-PCR的方法克隆获得SaglyA基因的全长序列,该基因编码417个氨基酸残基；通过简并引物克隆得到AnglyA基因全长序列,该基因编码440个氨基酸残基,与大肠杆菌SHMT有54.3%的相似性。重组的glyA基因在Escherichiacoli(E.coli)BL21(DE3)中进行表达。酶学性质研究表明SaSHMT酶最佳pH值为7.0,最佳温度为50℃,活性是同等条件下E.coli中SHMT的0.87倍。此外,通过分析AnSHMT酶催化机理、催化活性位点以及进行三维结构建模,在249位对该酶进行了定点突变。结果表明基于序列比对和生物信息学预测的249位的定点诱变(亮氨酸替换异亮氨酸)后突变子I249L的催化效率是野生型的2.78倍。本研究中通过两种方法对L-丝氨酸生产进行了研究,第一种方法是静息细胞系统(Restingcellsystein)法,利用完整的出发菌株转化L-丝氨酸,该方法主要用于高产丝氨酸菌株的筛选；第二种方法是酶促反应系统(Enzymaticreactionsystem)法,构建pET-15b-SaglyA工程菌并在反应体系中添加外源的辅酶。以10g/L的甘氨酸和26.6mmol/L的甲醛(流加)作为底物,该SaSHMT可以通过酶促转化生产L-丝氨酸77.76mM,催化甘氨酸到L-丝氨酸的分子转化率是相同条件下大肠杆菌的1.41倍。综上所述,本研究中基于理性设计对AnSHMT进行的定点突变为进一步的研究奠定了基础；SaSHMT酶促转化的研究为工业化生产L-丝氨酸提供了一条有利的途径,此外由于其具备碱性环境的耐受性和相对高的酶促转化率,从而在研究和工业应用上具有较大的潜在价值。
【作者】江伟；
【导师】刘子铎；
【作者基本信息】华中农业大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】L-丝氨酸；TAIL-PCR；SHMT；酶促反应系统；RP-HPLC；定点突变；催化效率；

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