猪链球菌2型双组分信号转导系统NisKR和BceRS对毒力调控的研究

【摘要】猪链球菌2型(Streptocuccussuis2,S.suis2)是一种非常重要的猪病原菌,可以引发猪的关节炎,心内膜炎,脑膜炎,肺炎和败血症,同时也可以引发人的致死性感染。近些年中国爆发的两次大规模S.suis2感染均引起人的中毒休克综合症,伴随有急性高热,多器官衰竭,病程短,致死率高的特点。这引发世界公共卫生的极大关注。近年来,国内外针对S.suis2开展了大量研究工作,然而对其迅速增强毒力的潜在机制知之甚少。双组分信号转导系统(two-componentsignaltransductionsystems,TCSTS)广泛存在于细菌中,该系统通过感受外界刺激来影响特定基因或操纵子的转录并调节细胞的变化,从而在调节细胞周期,发育途径,致病性等重要过程当中发挥的庞大的功能。关于双组分NisK/NisR,有报道认为它在乳酸乳球菌中调控乳链球菌素Z的合成；关于双组分BceR/BceS,它被证明在枯草芽胞杆菌参与形成四组分系统BceRS-BceAB,可以感知环境中抗菌肽并通过ABC运输蛋白将其从作用位点移走,从而提高细胞抵抗能力。然而这两对TCSTS在链球菌中的功能尚不清楚。NisK/NisR位于89K毒力岛上,该岛上另一对TCSTSSalK/SalR已报道是S.suis2高致病性的一个至关重要的因子。事实上很多双组分比如CiaRH,Ihk/Irr,VirR/VirS,RevSandCovR都已报道和S.suis2的致病性有关。因此,本课题以NisK/NisR和BceR/BceS为研究对象,探讨了这两对双组分对S.suis2毒力的影响,同时初步研究了两对系统可能调控的一些基因。主要研究内容：1.S.suis2双组分系统NisKR和BceRS基因缺失突变株的构建和鉴定依据猪链球菌二型05ZYH33全基因组序列设计引物。以SC19基因组为模板,温敏自杀性质粒pSET4s为穿梭载体,利用同源重组原理成功获得二次交换基因缺失突变株AnisKR和AbceRS,并通过PCR和Southernblot验证。2.S.suis2双组分系统NisKR和BceRS基因缺失突变株的生物学特性研究我们研究了突变株的生长特性和溶血活性,结果表明：野生株SC19相比,突变株在10%新生牛血清里的生长曲线无显著差异,但是溶血效价要降低2倍以上。我们进一步以小鼠和细胞为模型对基因缺失突变株AnisKR和AbceRS的毒力进行评价。细胞实验结果表明：AnisKR和AbceRS对Hela细胞的粘附能力显著降低(分别下降85.4%和53.05%),对该细胞的侵入能力也显著下降(分别下降90.9%和76.77%)；抵抗中性粒细胞(PMN)介导的杀菌作用的能力显著下降；更容易被小鼠肺泡巨噬细胞(RAW264.7)吞噬同时也更容易被该细胞杀死。BALB/c小鼠实验结果表明：以8×108CFU剂量的野生株和突变株分别腹腔注射1ml后观察到突变株组的临床症状较轻,死亡率显著低于野生株组；以5×107CFU剂量的野生株和突变株分别感染小鼠后,统计各个时间点血,心,肺,脑组织中的载菌量,发现突变株的含量显著低于野生株。这表明NisK/NisR和BceR/BceS在S.suis2致病过程中有着重要的地位。3.S.suis2双组分系统NisK/NisR和BceR/BceS调控机制的初步研究本研究提取各菌株RNA,通过转录组测序(RNA-seq)比较分析野生株和突变株的差异表达基因。结果显示：AnisKR中有22个基因下调2倍以上,7个基因上调2倍以上；AbceRS中有4个基因下调2倍以上,15个基因上调2倍以上。同时本研究成功的可溶性表达纯化了两个双组分的反应调控蛋白NisR和BceR,并首次尝试在S.suis2中建立DAP-seq(DNAAffinityPurificationSequencing)技术来寻找调控蛋白的结合位点,以便深入研究其调控机制。
【作者】徐娟；
【导师】陈焕春；谭臣；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】猪链球菌2型；双组分信号转导系统；毒力；调控机制；

【参考文献】
[1]王青青.玉米秸秆揉丝微贮饲料的制作及饲用效果研究[D].河南科技大学,养殖（专业学位）,2013,硕士.
[2]王刚.基于支持向量机的滚动轴承故障智能诊断研究[D].沈阳工业大学,机械工程,2013,硕士.
[3]谢娇.唐代婚姻成立的禁止条件[D].青海师范大学,中国古代史,2012,硕士.
[4]陈凌育,孙复川.辨识阅读眼动注视点参数的级联神经网络[J].自动化学报,1997,04:59-65.
[5]耿盈晴.学龄初期儿童所应掌握的诸多音乐能力及其训练[D].西安音乐学院,视唱练耳,2014,硕士.
[6]虞志龙.数据挖掘在医院药品采购系统中的应用[J].商场现代化,2005,26:106-107.
[7]韦英益.猪瘟病毒SM株单克隆抗体的制备、初步鉴定及应用研究[D].广西大学,预防兽医学,2004,硕士.
[8]张秀.《剑桥国际英语教程》与《交际英语教程》中任务的对比研究[D].广东外语外贸大学,外语教学技术与评估,2013,硕士.
[9]邱晓初.彩色铝板涂层机列增加清洗工作模式的实现[J].冶金自动化,2007,02:41-44.
[10]李思佳.木聚糖酶1YNA及其突变体在毕赤酵母中的表达和酶特性鉴定[D].中南民族大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[11]徐晓君.基于ESDA的湘西自治州城镇化空间格局研究[D].湖南师范大学,人文地理,2013,硕士.
[12]黄华学.组合式同相供电继电保护方案研究[J].电气化铁道,2014,05:17-20.
[13]韦桂锋.基于FPGA嵌入式实时目标跟踪系统设计[D].西安电子科技大学,物理电子学,2012,硕士.
[14]于会利.我国社会主义意识形态影响力研究[D].河北师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[15]刘晓园.食品包装设计中的色彩逆向思维研究[D].广西艺术学院,设计艺术学,2014,硕士.
[16]雷芸,江莹,钱坤,何静,陈禹成.石墨烯/TiO_2复合材料的制备及其光催化性能的研究[J].硅酸盐通报,2012,02:243-246.
[17]马春萍.六个图的图设计[D].河北师范大学,基础数学,2004,硕士.
[18]董宁.股骨头骨坏死合并髋关节感染的诊断和治疗[D].吉林大学,外科学,2013,硕士.
[19]张军.颅脑损伤后大鼠垂体远侧部ACTH细胞、肾上腺皮质细胞SDH和3β-HSD的变化[D].山西医科大学,病理学,2003,硕士.
[20]廖剑岚.数据仓库环境下的信息分析[J].情报杂志,2003,12:93-94.
[21]顾平灿.电磁振动给料器的建模与参数选择[D].浙江海洋学院,农业推广（专业学位）,2013,硕士.
[22]董卫华.越南、朝鲜、老挝、古巴执政党的社会管理理念比较[D].中南大学,马克思主义基本原理,2013,博士.
[23]马祥庆,刘爱琴,何智英.杉木幼林生态系统凋落物及其分解作用研究[J].植物生态学报,1997,06:77-83.
[24]郑荣生.关于上海轨道交通多线运营的思考[J].城市轨道交通研究.2002(03)
[25]朱玲玲.hsa-miR-143在人脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化及调控因素分析[D].南京医科大学,内科学,2013,硕士.
[26]黄铭石.利玛窦中文著译中的术语及专名研究[D].四川外国语大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[27]于越.移动警务实有人口信息采集中数据库管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[28]王罡琦.硝基化油酸（OA-NO2）调节脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的表达及分子机制研究[D].吉林大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[29]冯红海.基于网络的虚拟咨询系统[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[30]刘果.区域可持续发展指标体系研究[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[31]刘茂福,曹加恒,彭敏,叶可,林芝.多媒体文本数据的模式挖掘方法[J].武汉大学学报(理学版),2001,03:321-323.
[32]牙启康.南方红豆杉各部位中紫杉醇的含量测定和其果蒂氯仿萃取部分的成分研究[D].广西师范大学,有机化学,2003,硕士.
[33]刘磊.20世纪80年代以来法国华人文学的发展[D].四川外国语大学,法语语言文学,2014,硕士.
[34]邱萍.二语习得者道歉言语行为研究[D].华中师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[35]刘曰芳.谈电脑在工业上的应用前景[J].科学·经济·社会.1984(01)
[36]吕永杰.半导体激光器温湿度监测系统的研究[D].华中科技大学,光电信息工程,2013,硕士.
[37]梁春燕,李旻智,谢剑英.抑制柔性机械臂残留振荡的时滞滤波器设计[J].控制与决策,2001,06:943-946.
[38]于峰.京剧现代戏《杜鹃山》艺术研究[D].天津音乐学院,音乐学,2014,硕士.
[39]林俐,朱晨宸,郑太一,焦邵华.风电集群有功功率控制及其策略[J].电力系统自动化,2014,14:9-16.
[40]石峰.动荷载条件下冻土融化固结与变形研究[D].北京交通大学,道路与铁道工程,2014,博士.
[41]衣春雷.熔模铸造薄壁铸件工艺优化的实验及数值模拟研究[D].青岛理工大学,机械制造及其自动化,2012,硕士.
[42]王冬梅.白城市初中实施体育中考的现状调查及对策研究[D].东北师范大学,体育（专业学位）,2012,硕士.
[43]刘博.全尺寸绝缘子恒压覆冰闪络特性及其机理初步研究[D].中国电力科学研究院,高电压与绝缘技术,2012,硕士.
[44]王丹纯.海峡两岸中级对外汉语教材对比研究[D].华中师范大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[45]王海云.江苏弘业的出口营销策略优化研究[D].南京理工大学,工商管理,2012,硕士.
[46]谭忠盛,喻渝,王明年,杨建民.大断面浅埋黄土隧道锚杆作用效果的试验研究[J].岩土力学,2008,02:491-495+506.
[47]蒋式勤,石振荣,胡国四,王建桥,谷秋菊.合金称重系统的多任务数据通信及管理[J].冶金自动化,1998,03:20-23.
[48]冯惠珍.从中医体质与相关因素探索神经性皮炎的难愈性[D].广州中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[49]刘静.声音商标法律问题研究[D].海南大学,民商法学,2014,硕士.
[50]郑志琴.基于D-InSAR技术的矿区地表沉陷监测及其数据处理研究[D].西安科技大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.