喹赛多对C2C12肌管基因与蛋白表达的影响研究

【摘要】喹赛多作为新型喹噁啉类抗菌促生长饲料添加药物,与同类药物相比,具有更高的安全性。喹赛多对多种家畜家禽及水产动物均有较好的促生长作用。本实验室前期研究表明,喹赛多可提高猪体内循环GH和IGF-1的含量,能够诱导猪肝细胞IGF-1的表达量上调。GH和IGF-1位于动物激素生长轴中,可直接或间接的作用于肌肉组织,使动物整体表现出生长。那么喹赛多是否也能够直接调控直观体现动物生长的肌肉组织呢?探明喹赛多对肌肉组织有无直接作用,若有作用又是通过何种机制发挥作用,这为进一步探讨喹赛多促生长机制提供了理论依据和新思路。本研究以小鼠成肌细胞C2C12细胞系分化所形成的肌管为研究模型,首先选取了喹赛多作用细胞的最佳浓度和时间,然后通过基因芯片技术和双向电泳与质谱联用技术筛选出了喹赛多影响下差异表达的基因和蛋白质,并对喹赛多影响肌肉细胞的机制进行了初步探讨。1.喹赛多作用于C2C12肌管的最佳浓度与时间的选取本研究设置了喹赛多作用浓度梯度(1,2,4,8,12μM),通过BCA蛋白定量法分别测定了喹赛多作用C2C12肌管4h,8h,12h后的细胞总蛋白浓度。结果表明,2μM喹赛多处理细胞4h时细胞总蛋白含量相对空白对照组上调20%,统计学分析表明,差异极显著。这说明2μM、4h的药物作用浓度与时间为最佳组合,故以此条件进行差异表达蛋白的筛选。由于基因表达模式与蛋白质表达模式的时空关系不同,本研究又选取了基因指标来筛选喹赛多对细胞基因mRNA水平表达影响最为合适的作用浓度和时间。结合蛋白质定量结果,在五个梯度浓度中,8μM和12μM浓度喹赛多对C2C12细胞无促进作用,而细胞对1μM和41μM的药物作用浓度并不敏感,所以本研究直接采用2μM的药物浓度作用细胞,通过RT-qPCR技术,分别测定1h,2h,4h,6h时细胞内MyHC的nRNA表达量。结果表明4h时MyHC表达量最高,是空白组的2.4倍。故以此条件进行基因芯片分析,以实现对差异基因的检测。2.喹赛多作用C2C12肌管后差异表达的基因以2μM浓度的喹赛多孵育细胞4h,用基因芯片检测此时细胞基因组中相对于空白对照组nRNA表达量发生变化的基因。本研究共筛选出68个已知基因,其中32个基因上调表达,36个基因下调表达。对这些基因进行分析,按分子功能可将这些基因分为5类：结构组分、结合活性、酶活性、受体活性、转录活性；按生物进程可分为7类：蛋白质修饰、代谢、生物合成、调控、转录、应激、细胞生长。对C2C12肌管的生长相关基因进行分析,本研究推断,喹赛多影响肌肉细胞生长的可能机制为：一方面诱导细胞内Tceal7基因表达量上调,引发细胞进一步融合；一方面通过影响细胞内蛋白质磷酸化水平调节细胞内信号通路实现其促生长作用。此外,喹赛多还可增强细胞内nRNA转录调控活动,影响代谢相关基因差异表达,为细胞提供物质与能量。用RT-qPCR验证部分差异基因表达,各基因nRNA表达量变化趋势与芯片结果一致,证实本研究所得结果可靠。3.喹赛多作用C2C12肌管后差异表达的蛋白2μM浓度的喹赛多作用细胞4h后,经二维凝胶电泳和飞行时间质谱联用,检测发现,喹赛多处理组与空白对照组相比,有20个差异表达的蛋白鉴定成功,其中有18个表达量上调,2个下调表达。对这些蛋白的功能进行分析,差异蛋白在分子功能方面主要具备结合活性和酶活性,对其所参与的生物进程进行归类：物质与能量代谢、生物合成、细胞分化、信号转导、氧化应激。烯醇化酶Enol在喹赛多作用下的C2C12肌管中上调表达,细胞内骨架相关蛋白和肌肉分化相关蛋白均出现上调,预示喹赛多可能促发C2C12肌管重塑,进一步融合形成更为粗大的肌纤维。在喹赛多作用下,细胞内超氧化物歧化酶Sodl和过氧化物酶Prdx1含量增加,多种氧化应激相关蛋白上调表达,通过激活细胞内信号通路转导来应对氧化物刺激产生的不良影响。Sodl可将细胞内的自由基转化为H2O2,Prdx1可进一步清除H2O2,使细胞免受损伤。这提示喹赛多在代谢过程中可能产生了自由基,进而形成H2O2。研究表明,低浓度的H202对骨骼肌细胞内的PI3K/Akt及其它促生长相关信号通路有激活作用,是肌细胞中葡萄糖运输活化的重要调节物。我们推测,喹赛多可通过这种机制调节肌肉细胞的生长和生理功能。综上分析,本研究从分子层面阐述了喹赛多对肌肉细胞的影响及作用机制,发现喹赛多可能影响肌肉细胞的重塑与融合,促进细胞内的物质和能量代谢,改变细胞内蛋白的磷酸化水平。另外,喹赛多可能通过影响细胞内H2O2的含量,间接作用于促生长相关信号通路如PI3K/Akt,进而影响肌肉细胞的生长。
【作者】李文静；
【导师】戴梦红；
【作者基本信息】华中农业大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】喹赛多；C2C12肌管；基因芯片；双向电泳；细胞生长；

【参考文献】
[1]付革红,李淑丽,代红红.自组织模糊控制器在S5－115U上的开发[J].冶金自动化,1996,04:34-36.
[2]夏苗芬,梁文权,李士敏,王华.复方甲硫酸新斯的明眼用原位凝胶的处方工艺研究[J].中国现代应用药学,2014,06:711-713.
[3]孙德永.异形孔加工系统的设计及补偿方法研究[D].沈阳理工大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[4]周永辉.三类多孔材料的储香和吸附CO性能评价[D].华南理工大学,化学工程,2012,硕士.
[5]史磊.靶场红外弱小目标自动判读方法研究[D].哈尔滨工业大学,光学工程,2014,硕士.
[6]杨永川,达良俊.丘陵地区地形梯度上植被格局的分异研究概述[J].植物生态学报,2006,03:504-513.
[7]杨静.灵魂的风景—试论残雪小说的精神之维[D].河北师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[8]张治水.天然气汽车技术经济分析与研究[D].大连理工大学,动力工程,2003,硕士.
[9]李勋,段善旭,康勇,陈坚.三相四线UPQC系统的串联变流器控制策略[J].电力系统自动化,2007,06:57-60.
[10]徐建斌.中国长城资产管理公司风险管理体系改进研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[11]李川玉.我国城镇职工基本医疗保险水平的适度性研究[D].苏州大学,财政学,2012,硕士.
[12]王晨,康飞宇,顾家琳.铁钴镍合金粒子/石墨薄片复合材料的制备与吸波性能研究[J].无机材料学报,2010,04:406-410.
[13]王雪.生态涵养发展型县域主体功能区划研究[D].西南大学,人文地理学,2014,硕士.
[14]王景林.一段转化炉阻力增大的原因分析[J].一重技术.2006(05)
[15]崔树杨.从《新中国》杂志看1919年前后中国社会的“新中国”建设构想热潮[D].安徽大学,历史学,2013,硕士.
[16]刘伊生.建设工程项目管理的发展趋势——集成化[J].建筑经济,2008,01:13-16.
[17]彭日辉,罗力更,梁东图,王文英,马燕文.裂化塔焊缝缺陷鉴别[J].焊接学报.1985(04)
[18]茹保锋.基于人工免疫的供应链风险管理仿真研究[D].厦门大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[19]宫琪,田玉平.非线性交叉严格反馈系统的一种构造性设计方法[J].自动化学报,2000,04:447-453.
[20]刘锋.无粘结加劲钢板墙设计方法研究[D].清华大学,土木工程,2013,硕士.
[21]蒋延玲,周广胜.兴安落叶松林碳平衡及管理活动影响研究(英文)[J].植物生态学报,2002,03:317-322.
[22]任先文.脉冲电源研制及等离子体反应器能量注入效率的研究[D].大连理工大学,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[23]贺钟慧.企业年金成本测算及敏感性分析[D].上海交通大学,金融,2013,硕士.
[24]傅新华.重庆公运集团发展现代物流对策研究[D].重庆大学,2003.
[25]金磊.无知——酿成灾害[J].人民论坛.1995(12)
[26]马连君.弗吉尼亚·伍尔夫：现代女性主义文学批评的先驱[D].山西大学,英语语言文学,2004,硕士.
[27]徐慧贞.结社自由的法律问题研究[D].广西民族大学,法律,2013,硕士.
[28]刘洋.证券交易印花税拉弗曲线形式的实证分析[D].首都经济贸易大学,应用统计（专业学位）,2013,硕士.
[29]殷翠玲.译者惯习与儿童文学翻译语体问题研究[D].上海外国语大学,翻译学,2012,硕士.
[30]吴闽帆.基于随机变异优化选择规则的神经网络在股指期货价格预测中的应用[D].厦门大学,理论物理,2014,硕士.
[31]于小光.阜阳市城区中学开展阳光体育运动的现状与对策研究[D].安徽工程大学,体育人文社会学,2012,硕士.
[32]潘洪良.VLSI自动测试向量生成技术研究[D].黑龙江大学,集成电路工程,2012,硕士.
[33]蔡华.基于集成芯片的多功能细胞生理自动分析仪研究[D].浙江大学,2010.
[34]胡军.青藏高原湖泊表层沉积物磁化率特征及环境意义[D].兰州大学,环境科学,2013,硕士.
[35]樊兰兰.论薛瑄的“太极”说[D].湖北大学,中国哲学,2011,硕士.
[36]马国亮.科学发展观视域下县级政府绩效管理研究[D].山东师范大学,公共管理,2012,硕士.
[37]孙慧娟.黄侃《文心雕龙札记》之文章学理论辨要[D].内蒙古师范大学,文艺学,2013,硕士.
[38]刘嘉茵.北京南锣鼓巷历史文化保护区色彩控制研究[D].北京建筑大学,设计学,2013,硕士.
[39]王桃峰.船用螺旋桨多轴铣削加工过程动力学仿真[D].江苏科技大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[40]杨娣.港口经营人单位责任限制权利问题研究[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[41]朱婷婷.经理权法律制度研究[D].扬州大学,民商法学,2011,硕士.
[42]吴振.玖龙纸业的品牌管理研究[D].西北农林科技大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[43]赵萍.二甘醇对改性PET共聚酯热熔胶熔融及结晶行为影响的研究[D].华东理工大学,化学工艺,2014,硕士.
[44]陈龙.基于共生理论的船舶产业集群协同技术创新模式研究[D].江苏科技大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[45]彭嘉雄.均方差图象匹配系统的局部精度[J].自动化学报,1988,05:376-382.
[46]张晓芬.冬凌草甲素联合柔红霉素对jurkat细胞的增殖抑制作用及其机制的研究[D].泰山医学院,内科学,2012,硕士.
[47]孙豹.g-期望性质的研究[D].中国矿业大学,基础数学,2014,硕士.
[48]王少男.在“思考”和“道德”之间[D].华中科技大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[49]张闻.原油高温高压热解动力学模型的建立[D].中国石油大学（华东）,化学工程,2012,硕士.
[50]朱征.基于神经网络对发动机缸壁间隙识别研究[D].长安大学,载运工具运用工程,2014,硕士.