柑橘黄龙病Serralysin蛋白的表达纯化及两种重要病原的分子检测

【摘要】柑橘是在世界范围内种植面积最广、产量最大的重要的亚热带水果,但在柑橘种植、生产过程中存在一些严重问题,其中柑橘病害的广泛流行是影响柑橘产业的重要因素。1.柑橘黄龙病(HLB)是影响世界柑橘生产的最具毁灭性病害,目前我们对其致病机理还不太清楚。本文根据GenBank中提交的柑橘HLB亚洲型病原Serralysin蛋白基因序列,克隆了Serralysin蛋白N-端基因,命名为SerN;成功构建了含SerN基因的重组质粒pMD19-T-SerN,测序结果与GenBank中的原始序列100%同源；构建了重组表达载体pET24a-SerN,在E.coli中进行异源表达,通过Ni2+-NTA亲和柱纯化SerN蛋白,优化蛋白表达及纯化条件。2.SerN蛋白在不同表达菌株中进行表达,结果表明在E.colipLysS中表达情况较好,经超声破碎以后SerN蛋白在上清与沉淀中均有表达,多数以包涵体形式存在；采用不同IPTG浓度诱导SerN蛋白表达,结果表明在IPTG浓度为0.05mM时SerN蛋白在上清中的表达量最高；不同的Bindingbuffer对SerN蛋白进行纯化,结果表明Bindingbuffer对SerN蛋白纯化效果的影响并不明显,对蛋白溶解性没有明显改观；咪唑梯度洗脱结果表明SerN蛋白与Ni2+-NTA柱亲和能力弱,在咪唑浓度为5mM即随杂蛋白一起洗脱；降低Bindingbuffer中盐浓度不能提高SerN蛋白的溶解性,PBS缓冲液中NaCl浓度为500mM时蛋白在上清中表达量明显高于其他情况。3.对来自不同柑橘产区的101个样品进行柑橘HLB的常规PCR检测和实时定量PCR(QPCR)检测,判断其是否感染柑橘HLB。其中常规PCR检测出4个疑似携带柑橘HLB的样品,而QPCR检测出28个疑似携带柑橘HLB的样品。比较这两种检测方法,发现QPCR检测灵敏度远高于常规PCR检测,这可能与待测植株病菌含量有关。4.本文克隆了柑橘衰退病(CTV)病原p23蛋白(GenBank登录号为AFD33289.1)基因,并构建了重组质粒pMD19-T-p23,测序结果与NCBI上已提交的序列进行比对,同源率为100%,说明成功克隆了CTV病原p23蛋白基因(p23),可作为之后CTV检测的正对照。对来自不同柑橘产区的81个样品进行CTV的RT-PCR检测,结果表明75个样品携带有CTV病毒,6个样品没有检测到CTV病毒。
【作者】侯卫真；
【导师】姜玲；
【作者基本信息】华中农业大学，果树学，2014，硕士
【关键词】柑橘黄龙病；SerN蛋白；异源表达；Ni2+-NTA亲和纯化；柑橘衰退病；p23蛋白；

【参考文献】
[1]范存威.山区公路长下坡路段运营安全分析与评价[D].重庆交通大学,交通运输工程,2012,硕士.
[2]简阳天,王智,林青,孙振超.基于太赫兹光非对称解复用器的全光倍频技术[J].中国激光,2015,02:145-151.
[3]刘朋.刚性矿用自卸车电气系统研究[D].长安大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[4]秦嘉誉.省属高校董事会运行机制研究[D].渤海大学,教育学原理,2013,硕士.
[5]张奇.基于信息熵的Web信息抽取技术研究[D].广东工业大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[6]李玉珍.磁场中通入非平稳电流矩形薄板的随机振动[D].燕山大学,计算数学,2013,硕士.
[7]岳立松.基于模糊神经网络的水分智能控制系统[D].吉林农业大学,计算机应用与技术,2012,硕士.
[8]夏年军.基于数字图书馆的服务模式研究[J].图书馆论坛,2004,03:74-76.
[9]赵树山.特发性脊柱侧凸流行病学、遗传易感性及治疗的系统评价[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[10]陆莹.S&P500股票指数波动率研究[D].华中师范大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[11]向齐良.基于烧结终点预测的烧结过程智能控制系统及应用研究[D].中南大学,2008.
[12]文明浩.基于3个空间模量的能量平衡保护选相方法[J].电力系统自动化,2006,19:34-36+103.
[13]侯瑞杰.毛叶香茶菜化学成分研究[D].新乡医学院,药物化学,2012,硕士.
[14]郎帅.中国海外利益维护与拓展模式研究[D].吉林大学,国际政治,2013,硕士.
[15]吴智.基于拓展卡尔曼滤波器的斜率搜索方法在控制机翼流动分离中的应用[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[16]艾保保.西安市普通高校高水平女子篮球队管理现状分析研究[D].西北师范大学,社会体育指导,2014,硕士.
[17]李雪.我国养老保险基金监管问题探析[D].吉林大学,行政管理,2013,硕士.
[18]张鑫.基于RS与GIS的低碳经济发展与土地利用/覆被变化相关性研究[D].湖南科技大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[19]张颖.拉莫三嗪治疗育龄期女性癫癎患者临床疗效观察[D].第四军医大学,神经病学,2014,硕士.
[20]万秉风.2011中超联赛三支球队运动员比赛中高强度跑移动能力的研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[21]牛明改.水体富营养化藻类资源竞争与种群演替规律的初探[D].苏州大学,应用化学,2003,硕士.
[22]朱枭.由《尼采的春天》谈观念绘画的文化性[D].首都师范大学,美术,2014,硕士.
[23]周罗增.固相法制备锂离子电池正极材料xLi[Li_(1/3)Mn_(2/3)]O_2-(1-x)Li[Ni_(1/3)Co_(1/3)Mn_(1/3)]O_2及其性能研究[D].上海电力学院,应用化学,2013,硕士.
[24]柴天佑,荣莉,马庆云.智能控制技术在我国轧钢炉窑控制中的应用[J].冶金自动化,2000,01:7-11.
[25]洪小雨.主动配电网故障恢复重构研究[D].北京交通大学,2014.
[26]周核名.寒区农宅供热能耗统计及评价研究[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[27]吴一书,陈俊,赵美蓉,王鸿.活性追踪法分离海洋小红酵母中一个活性环二肽[J].中国海洋药物,2013,03:28-32.
[28]李荣玉.真空堆载联合预压加固堤防软土地基沉降预测研究[D].河海大学,岩土工程,2004,硕士.
[29]任俊红.基于语料库的英汉“海”的隐喻对比研究[D].安徽大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[30]安洪声,王成.秦皇岛市海水入侵现状及机理浅析[J].中国环境管理干部学院学报.2003(01)
[31]王芳.建筑墙体热阻现场检测方法研究[D].西南交通大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[32]靳赟婷.HX证券公司信息技术风险管理研究[D].北京交通大学,2014.
[33]彭湖.诗词歌赋翻译中的不定点及其具体化[D].西南交通大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[34]曹小栋.香巴噶举派的历史传承研究[D].西北民族大学,宗教学,2012,硕士.
[35]孙学方.基于模糊滑模控制的永磁电机直接转矩控制系统的研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[36]张平,蔡洁,代木林.我国风电产业特征及其发展路线探讨[J].资源开发与市场,2015,03:348-352.
[37]付卡利.中国水仙化学成分与生物活性研究[D].第二军医大学,药物化学,2013,硕士.
[38]王艳.徐州市农村初级中学武术开展现状的调查与对策研究[D].南京师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[39]孙金梁.“胡服骑射”改革理念对中国体育强国实践的借鉴研究[D].东北师范大学,体育人文社会学,2012,硕士.
[40]王璐.大学生成就目标定向与外语学习焦虑[D].华中科技大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[41]李璐.基于改进主成份分析的人脸识别算法研究[D].辽宁科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[42]苏仁杰.小婴儿中耳炎多频声导纳诊断研究[D].宁波大学,外科学,2013,硕士.
[43]薛静锋,曹元大.基于数据挖掘的入侵检测[J].计算机工程,2003,09:17-18+41.
[44]罗浩.CDMA/MC-CDMA系统中归整（Integer-Forcing）检测算法研究[D].西南交通大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[45]李岚.对外汉语功能型口语教材研究[D].吉林大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[46]田志强.生物酶与化学控制剂相结合控制化机浆造纸中的DCS[D].天津科技大学,制浆造纸工程,2010,硕士.
[47]刘巧玲.中西自然类纪录片创作与文化差异研究[D].华中农业大学,传播学,2014,硕士.
[48]李铁军.机动车污染控制与城市交通管理——北京市机动车污染控制对策分析及建议[J].道路交通与安全.2002(03)
[49]王慧林.商业银行信息系统审计方法的研究[D].吉林农业大学,计算机应用与技术,2012,硕士.
[50]赵勇.解吸附电晕束质谱法中分子间离子化效率抑制研究[D].湖南师范大学,分析化学,2013,硕士.