基于Cre/LoxP系统的皮肤特异性表达Tβ4基因载体构建及转基因细胞系筛选

【摘要】毛发是皮肤的附属物,哺乳动物毛发的生长要经历毛囊的发育和分化过程,这一调控过程涉及到许多的功能基因和生长因子的参与。通过转基因技术,将外源功能基因通过核移植的方式转入哺乳动物体内,使其在皮肤特异性表达,促进毛发生长,优质高产的转基因动物已获得成功。人们在利用转基因产品获得利益的同时,也必须重视转基因产品的安全性问题,要解决这一问题,如何删除标记基因是关键。本研究依据Cre-LoxP重组酶系统的特异性敲除功能,将已经构建好的皮肤特异性表达Tβ4基因的载体中的标记基因,进行选择性的删除,增加其转基因产品的安全性。同时为转基因绒山羊提供核供体。首先构建中间表达载体pMD19T-K14-Tβ4-PolyA,再进一步引入Cre/LoxP基因敲除系统,采用PCR技术,以pDsRed2-1载体为模板,人工克隆CMV启动子,构建皮肤特异性表达胸腺素β4的条件打靶载体pKT-L(功能元件顺序K14-Tβ4-PolyA-LoxP-CDsRed-LoxP),采用脂质体介导的方法分别转染内蒙古白绒山羊胎儿及皮肤成纤维细胞,经转染后在荧光显微镜下观察到发红色荧光的细胞汇合度超过50%后,加入适量的G418筛选,经过一周后,即可获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞克隆。PCR法验证细胞基因组中外源基因是否整合,采用半定量RT-PCR法检测(?)Tβ4mRNA在两种细胞中的丰度,Westernblot分别检测这两种细胞基因组中Tβ4蛋白的表达水平。测序结果显示,成功构建了皮肤特异性表达Tβ4基因的条件打靶载体pKT-L,且载体的各元件：角蛋白14启动子,Tβ4基因,PolyA,CMV启动子,LoxP序列和红色荧光蛋白均按正确的顺序连接。应用PCR方法检测到细胞内基因组中外源Tp4基因已成功整合。RT-PCR半定量实验中转Tβ4基因的细胞基因组中Tβ4mRNA的表达显著增加,Westernblot表明转Tβ4基因后细胞中蛋白的表达量也大大增加,且Tβ4mRNA水平在皮肤成纤维细胞比在胎儿成纤维细胞中表达量更高,表明K14皮肤特异性启动子发生了作用。本研究构建的皮肤特异性表达Tβ4的条件打靶载体,并且在绒山羊皮肤成纤维细胞中特异性表达目的基因。pKT-L转染的绒山羊胎儿成纤维细胞可以稳定的表达红色荧光蛋白,这些转Tβ4基因的细胞克隆,在构建的载体中成功引入Cre/LoxP基因敲除系统,为子代转基因产品中引入的外源标记基因的删除奠定了基础,保障了转基因产品的安全性。
【作者】李洋；
【导师】王志钢；
【作者基本信息】内蒙古大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】内蒙古白绒山羊；皮肤特异性表达；Tβ4基因；条件性打靶；

【参考文献】
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