胶胞炭疽菌ESO26 T-DNA插入突变体库的构建

【摘要】我国传统药用植物蛇足石杉的次级代谢产物石杉碱甲是一种高效的乙酰胆碱酯酶抑制剂,是治疗老年痴呆症的一个前景药物。人工合成石杉碱甲工艺复杂、成本昂贵、且得率较低,目前市场上石杉碱甲主要来源于野生蛇足石杉等石杉科植物。但石杉科植物生长周期长、生态环境复杂、资源开采过度、因含内生菌人工组培快繁又难以获得无菌苗,使得天然石杉碱甲的产量受到极大限制。基于内生真菌与其共生植物可以交换遗传物质这一理论,从蛇足石杉中分离产石杉碱甲的内生真菌已成为新的研究热点。本实验室在前期研究工作中已从蛇足石杉中分离出一株产石杉碱甲的内生真菌ColletotrichumgloeosporioidesES026,并已经申请专利。目前为止所获得的产石杉碱甲的菌株所产的石杉碱甲量还很低,整个石杉碱甲生物合成途径仍不完全,相关基因的研究鲜见报道,因此利用内生菌大量生产石杉碱甲还未应用到实践当中。本研究以分离得到的内生真菌ES026为材料,通过农杆菌介导转化,构建T-DNA插入突变体库,并利用TAIL-PCR与Inverse-PCR等技术手段对石杉碱甲合成途径中的相关基因进行克隆。旨在为培育石杉碱甲高产菌株、探究石杉碱甲合成途径,从而为利用微生物生产石杉碱甲奠定基础,同时为相关研究提供参考。主要研究结果如下：1.建立了农杆菌介导的C.gloeosporioidesES026的高效转化体系。在共培温度为25℃,共培时间为48h,400μM的乙酰丁香酮(AS),农杆菌浓度OD600=0.3-0.5,孢子浓度为1×106个/mL时,转化效率最高,达95个转化子/皿。目前利用此优化条件已建立了约含4000个转化子的胶孢炭疽菌ES026T-DNA插入突变体库。2.对农杆菌介导C.gloeosporioidesES026的突变体库的遗传稳定性进行了评估。从突变体库内随机选取13个转化子,在不含潮霉素和头孢霉素的PDA上连续培养5代,然后转到含200μg/mL潮霉素和150μg/mL头孢霉素的选择培养基上,结果发现所有测试的转化子各子代均能在选择培养基上生长,而野生型菌株C.gloeosporioidesES026不能生长。而且通过潮霉素特异性引物扩增,所有测试的转化子各子代和农杆菌载体均在1101bp处有扩增条带,而野生型菌株C.gloeosporioidesES026未扩增出条带,这说明T-DNA标记转化子在遗传上是稳定的。3.从突变体库中任选100个突变菌株对其发酵产物进行了表型的筛选,得到EST010005、EST010010、EST010021、EST010043、EST010044等5株表型较野生型菌株ES026有变化的菌株。对这5株突变菌株的石杉碱甲含量进行了液相分析,结果发现,突变菌株EST010044的石杉碱甲含量(7.73μg.g-1CDW)显著高于野生型菌株ES026的石杉碱甲含量(4.23μg.g-1CDW),约为1.83倍。而突变菌株EST010005(2.75μg.g-1CDW)、EST010043(2.78μg.g-1CDW)的石杉碱甲含量显著低于野生型菌株ES026,分别为其含量的0.65、0.66倍。4.为了评价表型突变菌株的T-DNA插入拷贝数,我们采取了基因组southern杂交分析的技术手段。经过southern杂交分析结果表明,有四个突变菌株(EST010005、EST010021、EST010010和EST010044)是单拷贝,单拷贝率达到了80%,而仅有一株(EST010043)是双拷贝,说明该插入体库具有较高的单拷贝比例。5.通过TAIL-PCR和Inverse-PCR技术对EST010044的侧翼序列进行扩增,序列拼接后经比对发现与胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)的甲基转移酶(methyltransferasedomainprotein)具有很高的同源性。
【作者】王文娟；
【导师】王沫；
【作者基本信息】华中农业大学，特种植物育种与栽培，2014，硕士
【关键词】胶胞炭疽菌ES026；农杆菌介导遗传转化；T-DNA插入突变体库；石杉碱甲；序列分析；

【参考文献】
[1]刘艳梅,钟辉,向军俭.重金属免疫学快速检测技术研究进展[J].食品科学,2014,17:306-311.
[2]李艳.H13钢焊接接头热疲劳性能的研究[D].吉林大学,材料加工工程,2014,硕士.
[3]赵阳.生物膜在犬上颌窦提升黏膜穿孔中的作用研究[D].山东大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[4]周红飞.论《反假冒贸易协议》对我国知识产权执法的影响[D].宁波大学,民商法学,2013,硕士.
[5]李杰.《伤寒论》中甘草功效与配伍应用的规律研究[D].广州中医药大学,中医临床基础,2013,硕士.
[6]胡玮琪.丝网印刷法制备SUS430合金LSM涂层的工艺及性能研究[D].景德镇陶瓷学院,材料学,2014,硕士.
[7]刘秀光.广西贵港市龙眼产业发展制约因素和对策研究[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[8]赵文溥.索辅体系斜拉桥索塔钢锚箱结构优化研究[D].吉林大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[9]李冰.运用FMS测试对黑龙江省田径运动员的体能分析与对策研究[D].哈尔滨工业大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[10]康传绿.实践性知识对英语教师成长作用的个案研究[D].宁波大学,课程与教学论,2013,硕士.
[11]刘卫.预加固对软弱围岩隧道掌子面稳定性的影响研究[D].北京交通大学,2013.
[12]陈振宇,秦雅坤,黄国四,伯平,刘玉松,韩树人,韩树人,高魁明,宋师伟,陆宪忠,陆宪忠,张钰元.会议报道[J].冶金自动化,1982,02:58-63+4.
[13]范晨光.创新社会管理的运行模式研究[D].吉林大学,公共管理,2014,硕士.
[14]张燕来.阵元失效对方向图影响及修复算法研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[15]刘亮前.中国直投杂志的现状与发展研究[D].湖南师范大学,出版（专业学位）,2014,硕士.
[16]丛力群,徐乐江,胡国奋.冶金企业信息化中MES功能及关键技术[J].中国制造业信息化,2004,04:71-74+79.
[17]尹传环.结构化数据核函数的研究[D].北京交通大学,2008.
[18]袁晓静.和谐社会视域下阶层矛盾问题研究[D].郑州大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2013,硕士.
[19]何湘婷.《中国企业员工参与模式工作报告》翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[20]熊凯.某高层剪力墙结构筏板基础沉降及水化热有限元分析[D].南昌大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[21]邱园园.语文教材文本解读策略的历史演进[D].鲁东大学,课程与教学论,2013,硕士.
[22]张利鹏.普通高校竞技体育的作用及制约因素的研究[D].重庆大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[23]祝保英.基于半导体制冷技术的番茄DFT营养液温控系统的应用研究[D].中国农业大学,农业生物环境与能源工程,2004,硕士.
[24]高政.移动3D高效引擎的研究和开发（Brew & Android）[D].北京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[25]张开利,王妮娅,杜金华,杜连祥.色度与啤酒组成的相关性研究[J].食品与发酵工业.2007(04)
[26]段丽莎.基于价值链理论的大型购物中心开发模式研究[D].武汉理工大学,土木工程建造与管理,2012,硕士.
[27].《高教与经济》2012年第1-4期(总第95-98期)目录[J].高教与经济,2012,04:63-64.
[28]高平.反垄断法适用除外法律问题研究[D].黑龙江大学,经济法学,2013,硕士.
[29]王兴军,满益志,刘昌国,张耀堂,赖敬容.低幅度构造变速成图技术[J].石油地球物理勘探,2008,S1:69-72+195+8-9.
[30]杨斌虎.伪随机序列相关的超声波测距系统研究[D].太原理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[31]菲尔·琼斯.年轻建筑师展示如何设计绿色建筑[J].城市环境设计,2014,Z1:172-191.
[32]胡飞.石墨带叠层复合结的电子输运性质[D].湘潭大学,2011.
[33]步华磊.年轻Ⅰ期子宫内膜癌患者保留卵巢可行性的meta分析[D].山东大学,妇产科学（专业学位）,2013,硕士.
[34]邢伟岩.混合动力电动汽车能量存储系统的性能研究及仿真[D].大连理工大学,车辆工程,2003,硕士.
[35]李文.创新与颠覆石墨烯应用步入新时代[N].中国高新技术产业导报,2015-06-29014.
[36]席道瑛,刘斌,谢端,刘卫,易良坤,张斌.孔隙流体饱和砂岩的衰减与频率的相关性[J].石油地球物理勘探,1998,01:66-70+77-138.
[37]李娜.城市轨道车辆运行节能方法优化研究[D].上海工程技术大学,车辆工程,2011,硕士.
[38]李宁.大黄对胃造口+盲肠切除术后大鼠的肠粘膜屏障保护作用的实验研究[D].山西医科大学,普外科,2013,硕士.
[39]辛洁.中国电视产业发展中的泛娱乐化现象研究[D].东北师范大学,广播电视艺术学,2012,硕士.
[40]路威.面向目标探测的高光谱影像特征提取与分类技术研究[D].中国人民解放军信息工程大学,2005.
[41]宋婷婷.社区慢性病患者知识服务过程护士角色功能研究[D].山西医科大学,护理学,2013,硕士.
[42]周云英.初中生数学学习过程中个性化思维特点的研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2003,硕士.
[43]徐亚.基于精益思想的货代业务流程优化研究[D].上海交通大学,物流工程,2013,硕士.
[44]王端.双层厢式自动装卸车的研制及动态特性研究[D].重庆大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[45]赵海,陈燕,张德干,张晓丹.相联规则的粗熵挖掘方法及其在肇事逃逸侦破中的应用[J].东北大学学报,2004,10:938-941.
[46]周悦.二极管反向恢复电流瞬变的研究[D].沈阳工业大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[47]乔向杰.基于Web和数据挖掘的智能教学系统的研究与开发[D].首都师范大学,2005.
[48]曾艳子.嘌呤碱基吸附和电氧化行为的压电电化学研究[D].湖南师范大学,2012.
[49]刘振杰.环境保护局数据中心的设计与实现[D].北京工业大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[50]刘栋.X射线在检测金属材料厚度中的应用[J].冶金自动化,2004,02:53-55.