骨髓X相关非受体络氨酸激酶在评估人脑胶质母细胞瘤患者预后中的作用研究

【摘要】第一部分BMX与CD133在胶质瘤细胞系中的表达关系以及BMX与胶质瘤恶性程度和化疗耐药相关性研究[目的]在胶质瘤细胞系中检测BMX的表达,以经典胶质瘤干细胞标记物CD133为参照,在胶质瘤细胞系以及胶质母细胞瘤冰冻切片上分析BMX与CD133共表达的关系；同时检测不同级别胶质瘤中BMX表达含量,分析BMX表达与胶质瘤恶性程度的相关性；通过免疫荧光共染,观察BMX与P-gp在胶质瘤细胞上的共表达情况,探究BMX在胶质瘤耐药机制中是否存在一定作用。[方法]随机选取WHOⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级四类胶质瘤标本,每一类标本3例,均来源于复旦大学附属华山医院神经外科手术标本,westernblot技术检测BMX在不同恶性程度胶质瘤中的表达情况。另外选取U138、U87、U373和T98四种基因表型各不相同的胶质瘤细胞系进行体外细胞培养,采用免疫荧光染色,观察BMX在细胞中的表达,同时与CD133荧光双染,观察BMX/CD133在胶质瘤细胞上共表达的情况；随机选取10例胶质母细胞瘤标本,同样来源于复旦大学附属华山医院神经外科手术标本,标本采集后即可使用OCT包埋,冰冻切片机中切片,切片厚度为4um,免疫荧光共染,观察BMX和CD133在冰冻切片上共表达的情况；体外培养U87细胞,荧光共染BMX和P-gp两种蛋白,培养间期,体外给予替莫唑胺10uM和100uM两种浓度行药物杀伤,观察BMX和p-gp荧光共表达的情况。[结果]westernblot结果显示BMX的蛋白表达水平与胶质瘤恶性程度相关,恶性程度越高,表达水平越高,不同级别胶质瘤间的表达水平均存在统计学差异(p=0.0000),在胶质母细胞瘤中表达水平最高(BMX/GAPDH=0.982±0.099)。而在U138、U87、U373和T98四种胶质瘤细胞中均发现BMX表达,同时在U87和U138中我们发现BMX/CD133呈共表达,其中,CD133阳性的肿瘤细胞均有BMX表达,两者表达程度正相关,但BMX阳性肿瘤细胞并不是全部都共表达CD133,在冰冻切片中我们也证实了上述结论,特别在肿瘤血管周边,肿瘤细胞中BMX/CD133共表达呈强阳性,BMX/CD133共表达肿瘤细胞簇集。在U87细胞中发现BMX还存在与P-gp共表达关系,在替莫唑胺作用下两者荧光强度随着替莫唑胺浓度的升高而升高(p=0.0000)。[结论]BMX在多个胶质瘤细胞系中均存在表达,与CD133呈共表达关系,按两者关系,可分为两组细胞亚型BMX/CD133++和BMX/CD133+-,但不存在BMX/CD133-+;胶质母细胞瘤冰冻切片上也证实了这一结果,同时发现BMX高表达的细胞多位于肿瘤血管周边,其表达程度同胶质瘤恶性程度相关,WHO诊断级别越高,BMX表达水平越高,并且可能作为一个胶质瘤的耐药指标。第二部分人脑胶质母细胞瘤差异预后标本基因表达谱分析以及相关BMX表达水平研究[目的]胶质瘤干细胞是影响胶质母细胞瘤患者预后的主要因素之一,我们通过对预后差异较大的胶质母细胞瘤患者进行基因表达谱检测和分析,探究BMX是否为一个差异表达基因,在预后较差的胶质母细胞瘤标本中显著上调,同时在不同预后的胶质母细胞瘤标本中存在差异表达。[方法]回顾性分析2009年-2012年复旦大学附属华山医院神经外科手术切除的胶质母细胞瘤病例,同临床随访,选取10例预后差异显著的病例,4例预后极好,6例预后极差,病理切片后行H&E染色,由神经病理科医生明确诊断为胶质母细胞瘤(WHOIV级)后,于我科胶质瘤组织库中寻找匹配的RNAlater处理后的冰冻标本,提取RNA,采用安捷伦基因芯片(G2505c)进行微距阵分析,分析结果通过GeneSpringGXsoftware,version11.5(AgilentTechnologies)软件分析,标准化纠正后,计算基因表达log比率,T检验P值,表达倍数大于2倍,且P值小于0.05被认为是差异性表达基因；选取前十位的差异表达基因(上下调各10个)在10例标本中进行qRT-PCR的验证。[结果]10例胶质母细胞瘤患者均在我科接受手术切除治疗,术中肿瘤均达肉眼全切,其中预后好的4例病例平均总体生存时间为21±3.46个月,预后差的6例病例平均总体生存时间为6.5±1.22个月,两者存在显著统计学差异(p=0.0002)；基因芯片结果显示差异表达基因共332个,其中206个基因表达上调,126个基因表达下调,表达上调基因前10位分别是：GPR26.PDYN.TAC1、SST、PNOC、SOHLH1、SCGN、SV2B、BMX、NEUROD2;表达下调基因前10位分别是：APOL4、CXCL10、UTS2、ISG15、RSAD2、NR4A3、IFI44L、AGR3、C12orf55、C9orf171。GO功能分析前10位分别是：synaptictransmission、transmissionofnerveimpulse、cell-cellsignaling、neurologicalsystemprocess、learningormemory、gatedchannelactivity、potassiumionbinding、metaliontransmembranetransporteractivity、cationchannelactivity、regulationoftransmissionofnerveimpulse。选取BMX作为目标基因,在十例胶质母细胞瘤标本中qRT-PCR验证结果显示：预后好的患者平均表达水平(4.018±0.832)明显低于预后差的患者平均表达水平(7.522±0.523),两者存在统计学差异(p=0.0017)。[结论]预后截然不同的胶质母细胞瘤患者平均总体生存时间有显著差异,在基因表达谱中可以明显区分,BMX作为胶质瘤干细胞标记物在预后较差的病例组中表达水平明显升高,在预后好的病例组中则表达明显下降。第三部分人脑胶质母细胞瘤中IDH突变情况、MGMT启动子甲基化水平、lp19q共缺失情况和BMX蛋白水平表达的研究和预后相关性分析[目的]BMX作为一种新型胶质瘤干细胞标记物和胶质瘤恶性程度相关,通过对于临床标本中BMX蛋白表达水平的检测和分析,旨在研究其与胶质母细胞瘤患者预后是否相关,同时以胶质瘤经典分子标记物IDH突变、MGMT启动子甲基化和lpl9q共缺为参照,进行单独和组合比较,旨在发现预测胶质母细胞瘤患者预后的最佳生物学标记物。[方法]回顾性分析了128例2002-2009年在复旦大学附属华山医院神经外科接受标准化治疗的胶质母细胞瘤病例(手术切除+术后同步放化疗+辅助化疗),整理归纳临床资料：性别、年龄、肿瘤部位、切除程度、术前术后一般情况；同时进行临床随访：肿瘤复发时间,最终死亡时间。拟定排除标准：死于临床并发症或伴发症、接受二次手术、失访。所有病例做石蜡切片,行H&E染色,交由香港威尔士亲王医院神经病理科主任吴浩强教授读片,明确病理诊断为胶质母细胞瘤(WHOIV级),白片上对肿瘤细胞区域做微切割,抽提DNA,采用甲基化特异性PCR检测MGMT启动子甲基化水平,普通PCR扩增DNA片段后进行直接测序,检测IDH突变情况,荧光原位杂交法检测lpl9q共缺失情况,免疫组化检测BMX表达水平,同时选取香港威尔士亲王医院神经外科67例随机胶质母细胞瘤病例作为验证组,IRS系统进行免疫组化计分,采用logrank检验分析四种标记物与患者总体生存时间的关系,绘制生存曲线,进一步行单因素和多因素分析。[结果]最终入组106例胶质母细胞瘤病例,男性63例,女性43例,小于30岁的3例(2.8%),30-40岁12例(11.36%),40-50岁24例(22.64%),50-60岁34例(32.08%),大于60岁33例(31.13%),额叶47例(44,34%),颞叶33例(33.13%),顶叶6例(5.66%),枕叶16例(15.09%),其它4例(3.77%),左侧62例(58.49%),右侧44例(41.51%),全切92例(86.79%),大部切除12例(11.32%),活检2例(1.89%),平均总体生存时间19.9±12.87个月,其中性别(p=0.157)、左右(p=0.7271)、手术切除程度(p=0.2381)对于预后没有影响,小于60岁的患者预后好于大于60岁的患者(中位生存时间18个月VS14个月,p=0.0175),顶叶患者预后相对较好(中位生存时间18个月,p=0.0017)。其中44例(37.74%)患者MGMT启动子存在甲基化,62(62.26%)例为非甲基化,甲基化组总体预后明显好于非甲基化组(中位生存时间20.5个月VS15.0个月,p=0.0028)；13例患者存在IDH1突变,93例患者为IDH野生型,两者中位生存时间无统计学差异,但IDH突变的患者预后要好于IDH野生型的患者(中位生存时间22个月VS17个月,p=0.1278)；BMX用4分做为cut-off,小于4分的患者预后明显好于大于4分的患者(中位生存时间22个月VS12个月,p=0.0000),验证组结果相同(中位生存时间14个月VS10个月,p=0.0054)；MGMT启动子甲基化、IDH突变和BMX三者两两组合或三三组合经统计学分析后发现MGMT启动子甲基化联合BMX表达小于4分对于预测胶质母细胞瘤患者预后效果最为明显(中位生存时间28个月VS9个月,p=0.0000)；其中在MGMT启动子甲基化和BMX表达小于4分的患者中,1pl9q检测均显示“多体性”,在MGMT启动子未甲基化和BMX表达大于4分的患者中,8例为“多体性”,2例为“对称”,两者未见明显差异。在10对自身初发及复发的配对标本中发现,8对出现BMX表达升高,2对则为BMX表达不变,EGFRvⅢ在配对标本均无表达。[结论]MGMT启动子甲基化水平和BMX表达水平可以作为预测胶质母细胞瘤预后的指标,两者联合预测作用更为明显,IDH突变情况对于预测胶母患者预后作用有限,lpl9q共缺失在指导胶质母细胞瘤患者的预后中无显著意义,BMX可能是胶质瘤复发和进展的关键因素。
【作者】史之峰；
【导师】毛颖；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】BMX；U138；U87；U373；T98；CD133；胶质瘤干细胞；胶质瘤恶性程度；微距阵；差异预后；MGMT启动子甲基化；IDH突变；1p19q共缺失；总体生存时间；胶质瘤复发；

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