鱼类淋巴囊肿病毒32kDa黏附蛋白的特性分析

【摘要】淋巴囊肿病毒（lymphocystisdiseasevirus,LCDV）是鱼类淋巴囊肿病的病原，呈世界性分布，可感染42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。该病自1997年在我国山东威海地区的养殖牙鲆中首次暴发以来，迅速蔓延至辽宁、河北、浙江等沿海省份，给我国的鱼类养殖业造成巨大经济损失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒，囊膜病毒通过囊膜上的单个或多个黏附蛋白与宿主靶细胞上的受体蛋白发生特异性结合而吸附到靶细胞表面，介导病毒与细胞上的蛋白发生构型变化，促进宿主细胞膜与病毒囊膜融合，使病毒的遗传物质进入细胞内部进行复制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白对于阐明病毒感染和致病的分子机制具有重要意义。实验室前期曾在牙鲆（Paralichthysolivaceus）鳃细胞（FG）上鉴定出一个分子量为27.8kDa的LCDV细胞受体蛋白，并制备了2株抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体（2G11、3D9），2株抗体都能有效阻断LCDV对FG细胞的感染。应用抗27.8kDa受体蛋白单克隆抗体与Far-western技术在LCDV上发现一个分子量为32kDa的蛋白能够与27.8kDa受体蛋白特异性结合，质谱鉴定结果表明该32kDa蛋白是LCDV上038开放阅读框（Openreadingframe038，ORF038）编码的蛋白。本论文通过构建LCDVORF038基因的原核表达载体，重组表达得到ORF038蛋白，制备了其多克隆抗体，并对该32kDa病毒蛋白进行了特性分析，证明该蛋白是LCDV的黏附蛋白，在病毒入侵FG细胞中发挥重要作用，为研究LCDV感染宿主的分子机理，以及寻找阻断病毒感染的有效途径提供了基础资料。具体研究结果如下：根据LCDVORF038基因序列，设计特异性引物，将ORF038基因和pET-32a表达载体进行定向克隆，构建了LCDVORF038融合表达载体pET32a-ORF038，转入大肠杆菌Escherichiacoli表达菌BL21（DE3），亲和层析柱（GE）纯化重组表达蛋白，获得分子量大小为50kDa的重组表达蛋白；利用该重组蛋白免疫新西兰白兔，制备了兔抗ORF038重组表达蛋白多克隆抗体（多抗）；对LCDV总蛋白和ORF038重组表达蛋白进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting分析，结果显示在分子量约32kDa和50kDa处出现特异性反应条带，而阴性对照无条带出现，表明该抗体具有良好的特异性。利用制备的兔抗ORF038重组蛋白血清与LCDV孵育，胶体金标记羊抗兔IgG作为二抗，免疫电镜技术定位ORF038蛋白编码的32kDa病毒蛋白在LCDV上的分布，结果显示，胶体金颗粒位于LCDV粒子的囊膜上，表明ORF038基因编码的32kDa蛋白是LCDV的囊膜蛋白。利用FITC标记的LCDVORF038重组表达蛋白与FG细胞孵育，免疫荧光实验结果显示，在FG细胞表面出现绿色阳性信号，表明该重组蛋白能够与FG细胞膜上的受体蛋白结合。阻断ELISA实验发现ORF038重组表达蛋白可以阻断单克隆抗体（2G11、3D9）与27.8kDa受体蛋白间的结合，阻断率为63.2%；体外感染中和实验中，将ORF038重组表达蛋白兔多抗进行梯度稀释，并与LCDV预孵育，然后感染FG细胞。结果发现，随着抗体浓度的增加，FG细胞出现CPE的时间相应延迟，且发生病变的细胞数量明显降低，抑制效果与多抗浓度存在剂量依赖效应，表明该兔多抗可以有效中和LCDV，进一步证明LCDV的32kDa蛋白是病毒黏附蛋白，能够与FG细胞上27.8kDa受体蛋白相互作用，在LCDV入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。
【作者】费辰杰；
【导师】绳秀珍；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】淋巴囊肿病毒（LCDV）；黏附蛋白；27.8kDa受体蛋白；蛋白质相互作用；抗体；

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