栉孔扇贝（Chlamys farreri）性类固醇激素和17β-羟类固醇脱氢酶8在性腺发育过程中的潜在作用

【摘要】研究表明性类固醇激素广泛地存在于软体动物中，并在软体动物生殖过程中发挥着潜在的重要作用，但是目前对软体动物内分泌系统的了解还十分有限，而且在软体动物性类固醇激素的来源和功能机制等问题上还存有争议。栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是一种雌雄异体、性别稳定的双壳贝类，是我国北方重要的经济物种。本研究以栉孔扇贝为研究对象，首先检测了栉孔扇贝年生殖周期性腺中雌二醇和睾酮的含量逐月变化，探讨了性类固醇激素在栉孔扇贝生殖过程中的潜在作用；克隆并鉴定出了17β-羟类固醇脱氢酶8（17β-HSD8）基因，并对其序列特征和体外催化活性进行了分析；进一步，研究分析了17β-HSD8在栉孔扇贝性腺和胚胎、幼虫中的时空表达模式，并探讨了其在性类固醇激素合成代谢途径、配子发生和个体早期发育过程中的潜在作用。为了探讨性类固醇激素在栉孔扇贝生殖过程中的潜在作用，本文通过酶联免疫吸附技术（ELISA）检测并分析了2012年1月到12月期间栉孔扇贝性腺中雌二醇和睾酮含量的变化。根据配子发生和排放过程的组织学特征，我们将栉孔扇贝性腺年生殖周期划分为休止期、增殖期、生长期、成熟期、第一次排放期、恢复期和第二次排放期共七个时期。在栉孔扇贝年生殖周期过程中，性腺中雌二醇含量变化范围是75.07pg/g~666.24pg/g，而睾酮含量变化范围是91.09pg/g~506.28pg/g。栉孔扇贝卵巢中雌二醇的含量全年高于精巢雌二醇含量，而精巢中睾酮的含量在配子发生阶段高于卵巢睾酮含量。卵巢中雌二醇的含量和精巢中睾酮的含量均随着配子发生而升高，在配子排放前达到最高值，并在配子排放后迅速下降。栉孔扇贝卵巢中雌二醇含量和卵径具有正相关性（r=0.743，P<0.05，n=25），表明雌二醇可能在卵子发生过程中发挥重要作用。栉孔扇贝性腺中性类固醇激素含量的变化及其与生殖过程的相互关系说明，性激素在性别维持、性腺分化、配子发生和排放等过程中均发挥着重要在潜的作用。在脊椎动物中，17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSDs）是类固醇合成和代谢途径中的关键酶之一。尽管研究表明性类固醇激素在软体动物的生殖过程中具有重要作用，但是软体动物中17β-HSDs的存在和功能研究还很少。本文在栉孔扇贝中克隆并鉴定出了17β-HSD8基因，该基因cDNA全长1104bp，具有759bp的开放阅读框（ORF），编码252个氨基酸。系统进化分析表明，栉孔扇贝17β-HSD8属于短链脱氢酶超家族（SDR），并与其他动物中的17β-HSD8具有高度的同源性。本文使用原核表达系统在大肠杆菌（E.coli）中表达出了栉孔扇贝17β-HSD8重组蛋白，并通过复性获得了可溶性的17β-HSD8蛋白。体外酶活性实验揭示，复性的17β-HSD8以NAD+作为辅酶，可有效地催化雌二醇转化为雌酮，并可较弱地催化睾酮转化为雄烯二酮。半定量RT-PCR结果显示，17β-HSD8mRNA在增殖期栉孔扇贝各组织中均有表达，并在消化腺、肾脏和卵巢中表达量较高，在外套膜、肌肉、鳃和精巢中表达量较低。qRT-PCR和Westernblot结果显示：卵巢和精巢中17β-HSD8mRNA和蛋白的表达量均随着配子发生过程逐渐升高；在生长期和成熟期精巢中17β-HSD8的表达量显著性地高于卵巢。原位杂交和免疫组化实验结果显示，栉孔扇贝17β-HSD8mRNA和蛋白在滤泡细胞和各期配子（除精子外）中均有表达；配子中阳性信号的强度随着配子的发育逐渐降低。这些研究结果表明，栉孔扇贝17β-HSD8参与调控配子发生过程；进一步分析发现，这种调控作用可能是通过调节雌二醇水平实现的。对栉孔扇贝胚胎和幼虫中17β-HSD8mRNA的时空表达模式研究结果显示：栉孔扇贝17β-HSD8在未受精卵中即有高水平的表达，显示它是一个母源性表达的基因。在卵裂期胚胎中17β-HSD8的表达量显著下降，但是囊胚中其表达量显著提高，暗示17β-HSD8合子基因在此时期开始表达。在随后的胚胎和幼虫发育过程中17β-HSD8的表达量呈波动性变化。原位杂交结果显示，17β-HSD8mRNA阳性信号在各发育阶段胚胎中均匀分布，推测17β-HSD8可能通过调节性类固醇激素水平参与栉孔扇贝早期发育的调控。此外，在D形幼虫中17β-HSD8mRNA高水平表达，并且内脏团附近17β-HSD8阳性信号强度较高，表明17β-HSD8可能也参与起始器官发生。综上，栉孔扇贝雌二醇和睾酮在性别维持、性腺分化、配子发生和排放等生理过程中具有潜在的重要作用；17β-HSD8通过调节性腺中类固醇激素含量参与调控配子发生过程，并且可能与胚胎发育和幼虫器官发生过程有关。本研究为深入探讨栉孔扇贝等软体动物中性类固醇激素的合成代谢途径及其在生殖和发育过程中的生理作用提供了科学依据。
【作者】刘建国；
【导师】张志峰；
【作者基本信息】中国海洋大学，发育生物学，2014，博士
【关键词】栉孔扇贝；性类固醇激素；17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSD8）；性腺；配子发生；早期发育；

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