几种海参岩藻聚糖硫酸酯结构解析及构效关系初步研究

【摘要】海参岩藻聚糖硫酸酯（SC-FUC）是海参的主要功效成分之一，属于岩藻聚糖硫酸酯类化合物，具有多种生理调节功能，在功能食品的开发方面展现出良好的应用前景。目前关于SC-FUC结构研究的报道仍十分稀少，结构信息的匮乏限制了SC-FUC的深入研究及开发利用。基于此背景，本研究解析了三种SC-FUC的结构，并进一步结合其功能研究的结果，探究了SC-FUC的构效关系。糖苷酶是解析多糖结构的重要工具，但目前尚无商品化的岩藻聚糖硫酸酯酶可供使用。实验室前期自主筛选得到一株海洋细菌Flavobacteriaceaesp.CZ1127，并从其胞内分离纯化得到含岩藻聚糖硫酸酯酶的酶液，命名为CZ1127FUCase。在此基础上，本研究首先利用已知结构的美国肉参岩藻聚糖硫酸酯（Ib-FUC）作为底物，研究了该岩藻聚糖硫酸酯酶作用方式。实验结果表明该岩藻聚糖硫酸酯酶为内切酶；通过解析酶解产物中两个最小寡糖片段的结构，推断该岩藻聚糖硫酸酯酶主要作用于α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp之间的糖苷键。后续实验将以CZ1127FUCase为工具解析其他未知结构的SC-FUC。以梅花参(Thelenotaananas)为原料，提取得到梅花参岩藻聚糖硫酸酯（Ta-FUC），其分子量为1284KDa，硫酸根含量为28.2±3.5%，组成单糖仅为岩藻糖。利用CZ1127FUCase降解Ta-FUC得到寡糖及低分子量多糖，利用电喷雾电离-碰撞诱导解离-串联质谱（ESI-CID-MS/MS）和核磁共振技术（NMR）解析其结构，发现其结构中都存在重复的四岩藻糖单元α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)。由此推断，Ta-FUC的结构为[→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n。这是一种新型岩藻聚糖硫酸酯结构。单纯利用CZ1127FUCase降解海地瓜岩藻聚糖硫酸酯（Am-FUC）制备寡糖的效率较低。针对此情况，首先利用CZ1127胞内酶液（含岩藻聚糖硫酸酯酶，硫酸酯酶和岩藻糖苷酶酶活）降解Am-FUC得到寡糖混合物，通过液质联用技术分析混合物中的寡糖组成，并利用SuperdexTMPeptide串联定向纯化主要寡糖。ESI-CID-MS/MS和NMR的结果显示，四种主要寡糖组分的结构分别为α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp、α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp、α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp、α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp。利用CZ1127FUCase降解多糖得到低分子量岩藻聚糖硫酸酯，采用NMR解析其结构，发现其由四糖重复单元α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)组成。结合寡糖的结构信息以及CZ1127FUCase作用方式，最终推断Am-FUC的结构为[→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n，这也是一种新型的岩藻聚糖硫酸酯结构。通过红外光谱，NMR和甲基化实验分析了仿刺参岩藻聚糖硫酸酯（Aj-FUC）的结构信息，发现其主要由α-L-Fucp2(OSO3-)和α-L-Fucp组成，糖苷键主要有α1→3及α1→4两种类型，支链出现在岩藻糖残基的4位。利用CZ1127FUCase降解Aj-FUC得到低分子量多糖Aj-LMW，通过NMR解明其结构为[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3(α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→)4-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n。Aj-FUC的结构可能并不完全规律均一，Aj-LMW的结构约占多糖整体结构的80%以上，因此，可以反映Aj-FUC的主要结构特征。比较研究了Ta-FUC、Aj-FUC、Am-FUC及Ib-FUC四种SC-FUC抗氧化和抑制肿瘤细胞增殖的功能，从而对SC-FUC的构效关系进行探索。结果表明：SC-FUC的抗氧化和抑制肿瘤细胞增殖的功能不仅与其硫酸根含量有关，还与硫酸化位点和支链取代等精细结构特征密切相关。综上所述，本文以自主筛选的岩藻聚糖硫酸酯酶为特色工具，制得SC-FUC酶解寡糖。通过ESI-CID-MS/MS和NMR等先进技术，建立了SC-FUC精细结构解析平台，并解明了3种新颖的SC-FUC结构。初步分析SC-FUC的构效关系，发现SC-FUC的精细结构与其功能密切相关。该研究为SC-FUC的深入研究和开发利用奠定基础。
【作者】于龙；
【导师】薛长湖；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产品加工及贮藏工程，2014，硕士
【关键词】海参；岩藻聚糖硫酸酯；岩藻聚糖硫酸酯酶；结构解析；构效关系；

【参考文献】
[1]关会娟.中国服务业生产效率区域非均衡性研究[D].河北经贸大学,统计学,2014,硕士.
[2]张玉富.小脑扁桃体下疝畸形Ⅰ型改良术式疗效研究[D].第四军医大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[3]杨雪敏.硅烯和二硅烯环加成反应机理的理论研究[D].杭州师范大学,有机化学,2013,硕士.
[4]贺方刚.情感与理性：康德宗教哲学内在张力及调和[D].山东大学,宗教哲学,2014,博士.
[5]穆军芬.K（lnK）～q和M(lnM)～q（q>0）的定义及性质[D].河北工业大学,应用数学,2004,硕士.
[6]许友军.几类非线性椭圆偏微分方程的正解[D].曲阜师范大学,应用数学,2004,硕士.
[7]郑双明.短肢剪力墙—砌块组合墙受力特征及计算方法研究[D].西安建筑科技大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[8]赖生华,梁全胜,曾洪流,李鹏飞.煤层对砂岩地震反射特征的影响及其地震岩性学意义——以鄂尔多斯盆地山2段为例[J].石油地球物理勘探,2015,01:136-143+18.
[9]张淑锋.论人民法院对行政机关强制执行申请的审查[D].广东财经大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[10]李晓冲.小鼠NAFLD模型建立及Nrf2缺失对肝脏中CYP2A5表达的影响[D].东北农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[11]刘兆喜.NEFA和BHBA对酮病奶牛氧化应激状态的影响[D].吉林大学,临床兽医学,2013,硕士.
[12]王明莉.碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因（ScBADH）的表达分析以及在拟南芥中的功能鉴定[D].吉林农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[13]童庆海.核电厂安全壳及内部结构基于性态的抗震能力评估[D].哈尔滨工业大学,工程力学,2013,硕士.
[14]黄书才.冰箱压缩机消声器的性能分析与优化研究[D].华中科技大学,流体机械及工程,2012,硕士.
[15]冯丽艳.创业板上市公司公司治理对其发布年报补丁的影响研究[D].河北经贸大学,会计,2014,硕士.
[16]张亚辉.基于ARM的阻抗测量系统的设计[D].西北师范大学,电路与系统,2013,硕士.
[17]吕芝.凯亚商贸公司进销存管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[18]吴燕茹.基于RS_GIS的石漠化现状及分区研究[D].西南大学,自然地理学,2013,硕士.
[19]魏延涛.河南省气象技术装备监控管理系统研究[D].郑州大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[20]李正.长链非编码RNA-LLEST在急性髓系白血病中的功能研究[D].苏州大学,血液病学,2013,硕士.
[21]王婷婷.清代州县幕友及其文书档案工作[D].苏州大学,档案学,2013,硕士.
[22]高敏杰.南京市停车场需求分析及管理[D].南京林业大学,森林工程,2004,硕士.
[23]樊刚强.复杂产品协同设计过程建模关键技术研究[D].沈阳理工大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[24]柏亚东.《文选》李善注引《方言》研究[D].华东师范大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[25]张海运.面向欠/全驱动机械系统的层级化自组织控制方法研究[D].浙江大学,机械设计及理论,2014,博士.
[26]王金连,赵歌.美学视阈下国际跳水评分规则形成与发展进程中的理性审视[J].北京体育大学学报,2015,04:33-37+57.
[27]金龙.网络舆情对我国政府决策的影响研究[D].安徽大学,2010.
[28]钟怀蓉.基于.NET的结婚用品电子商城设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[29]马跃青.籽叶两用茶园管理技术的研究[D].安徽农业大学,营养与食品卫生,2012,硕士.
[30]王小柠.论“五方”观念对中国传统山水画方位意识的影响[D].扬州大学,美术学,2012,硕士.
[31]黄月.建筑物区分所有权之共有权研究[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[32]马林瑞.杜威思维五步法评析[D].长安大学,科学技术哲学,2014,硕士.
[33]刘晓燕.山东联通移动核心网网络优化方案设计[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[34]范磊.转型变革情景下职业经理人胜任能力模型与开发策略研究[D].浙江大学,企业管理,2014,硕士.
[35]李红兵,佟东.论外资控制对港口产业安全的威胁[J].山东工会论坛,2014,03:105-107.
[36]尚青青.多场所多路高清视频监控中心的设计与实现[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[37]周继德.用功率曲线调整抽油机平衡的方法[J].油田地面工程.1989(01)
[38]陈杰,陈博.隧道施工围岩力学参数的动态辨识方法研究[J].湖南交通科技,2014,04:114-117.
[39]李志虎.甘露聚糖肽对细胞因子诱导的杀伤细胞的活性的影响[D].兰州大学,内科学,2013,硕士.
[40]武雨川.半套结工艺的空间造型在女装设计中的运用研究[D].东华大学,艺术设计（专业学位）,2014,硕士.
[41]陈璐.基于食品安全认知的消费者食品消费行为研究[D].湖南农业大学,企业管理,2012,硕士.
[42]吴晓琛.辣椒胚珠的组织化学及卵器钙离子分布特征的研究[D].厦门大学,水生生物学,2014,硕士.
[43]于志川.高绩效人力资源管理实践对员工角色行为影响机理研究[D].天津理工大学,企业管理,2013,硕士.
[44]徐丽昕.GADD45基因表达作为生物剂量计的可行性研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,内科学,2004,硕士.
[45]王青.陕西省化工类建设项目环境管理体系研究[D].西北大学,环境工程（专业学位）,2012,硕士.
[46]郭小青.不同元素饱和石墨烯纳米带的第一性原理研究[D].烟台大学,2012.
[47]纪芳芳.马克思主义生态文明观与当代社会生态系统问题研究[D].山西师范大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[48]邢玉月.基于阅读的写作模式在中专英语写作教学中的实证研究[D].沈阳师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[49]杨婷婷.我国中小企业融资问题研究[D].山西财经大学,会计学,2013,硕士.
[50]幸丽娟.基于合作博弈的联盟企业利益分配问题研究[D].西北民族大学,应用数学,2012,硕士.