莱茵衣藻与根瘤菌共培养提高产氢及其生理生态学机理

【摘要】生物质能源技术是解决当今世界能源危机、环境危机和粮食危机的重要途径之一。光合微藻制氢技术是未来清洁能源可持续生产的重要组成部分。莱茵衣藻(以下简称衣藻)因为氢化酶活性高、生长速度快、适应力强、培养成本低、遗传背景清晰和分子操作系统成熟,成为研究微藻光合制氢的模式物种。衣藻氢化酶对氧气极其敏感导致其产氢效率极低是制约衣藻产氢技术应用的瓶颈问题。目前国际上提高衣藻产氢效率的策略主要有：(1)抑制PSⅡ光解水放氧活性；(2)改造氢化酶结构提高耐氧性；(3)快速降低培养系统细胞内氧气；(4)基因工程手段构建高效产氢藻株；(5)调控培养条件；(6)以藻类作为有机底物与产氢细菌和光合细菌共培养。其中利用藻菌相互作用产氢的策略是一种环境友好的、且具有良好发展前景的清洁能源生产的新思路。本课题组的前期工作曾发现将衣藻与环境中易污染细菌共培养可以加快共培养体系内的氧气消耗速度、提高产氢量；进一步将衣藻与日本慢生大豆根瘤菌(以下简称根瘤菌)混合共培养,发现可以显著提高衣藻产氢效率达3.5～17.0倍。为了深入了解根瘤菌促进衣藻产氢代谢的原因,本研究将不同的衣藻藻株与根瘤菌混合共培养,对培养条件进行了优化,对最佳产氢状态下共培养体系中藻菌分布格局、产氢量、耗氧量、氢化酶活性、细胞内外碳水化合物和有机酸等的动态变化进行了检测,取得的主要结果如下：1.不同衣藻藻株与根瘤菌混合共培养,产氢量都明显提高,最大产氢量提高到约为200μmol·mg-1Chl～278μmol·mg-1Chl;但藻株不同,其最佳产氢条件并不相同：根瘤菌与转基因藻hemHc-lbac最优的产氢条件为30μE·m-2·s-1光照,菌藻体积比为1：80,氢气产量为最大值278μmol·mg-1Chl,是纯藻培养体系80μmol·mg-1Chl的3.5倍；根瘤菌与衣藻cc124共培养的最优条件为200μE·m-2·s-1光照,菌藻体积比为1：80,氢气产量最大值为272μmol·mg-1Chl,是纯藻培养体系16μmol·mg-1Chl的17.0倍；根瘤菌与衣藻cc503共培养的最优条件为200μE·m-2·s-1光照,菌藻体积比为1：20,氢气产量最大值为302μmol·mg-1Chl,是纯藻培养体系69μmol·mg-1Chl的4.4倍。2.通过设置不同的对照组实验,揭示了根瘤菌与衣藻共培养系统中产氢的是衣藻,而根瘤菌不产生氢气。3.根瘤菌与衣藻在共培养开始至产氢高峰期,根瘤菌聚集在衣藻细胞周围,有“团聚”现象,而且衣藻的细胞数与叶绿素含量和根瘤菌的细胞数都比未混合培养的对照组明显增加；在共培养的后期,衣藻细胞解体。表明在共培养过程中根瘤菌与衣藻之间产生了阶段性互惠共生。但在产氢高峰期之后,衣藻的生存受到严重胁迫,衣藻开始逐渐解体。4.藻菌共培养体系中,其呼吸速率和氧气消耗速度都明显比未混合培养的对照组高,这是衣藻产氢量提高的直接原因。转基因藻hemHc-lbac与根瘤菌共培养产氢后的第4天呼吸速率为5.04μmolO2·mgChl-1·h-1,是纯衣藻体系3.0μmolO2·mgChl-1·h-1的1.4倍；转基因藻hemHc-lbac加入根瘤菌产氢后的溶氧值最小为0.57mg/L,而纯藻体系为3.16mg/L,是藻菌体系的5.5倍；衣藻cc124与根瘤菌共培养产氢后第2天呼吸速率为6.05μmolO2·mgChl-1·h-1,是纯衣藻体系5.12μmolO2·mgChl-1·h-1的1.2倍；衣藻cc124加入根瘤菌产氢后的溶氧值最小值为2.18mg/L,而纯藻体系为5.08mg/L,是藻菌体系的2.3倍；衣藻cc503与根瘤菌共培养产氢后第5天的呼吸速率为3.34μmolO2·mgChl-1·h-1,是纯衣藻体系1.26μmolO2·mgChl-1·h-1的2.6倍；衣藻cc503加入根瘤菌产氢后的溶氧值最小为0.47mg/L,而纯藻体系为7.34mg/L,是藻菌体系的15.6倍。5.在藻菌共培养产氢体系中,衣藻氢化酶活性明显增加,佐证了混合培养体系中氧气消耗速度快是衣藻产氢量提高的重要原因之一。转基因藻hemHc-lbac与根瘤菌共培养产氢后体外氢化酶最高活性约为57.9nmoH2μgChl-1·h-1比未加入根瘤菌的体系提高1.1倍,体内氢化酶最高活性约为25.3nmolH2μgChl-1·h-1,是纯藻培养的1.5倍；衣藻cc124与根瘤菌共培养产氢后,体外氢化酶最高活性约为51.0nmolH2μgChl-1·h-1,比未加入根瘤菌的体系提高1.0倍,体内氢化酶最高活性约为13.0nmolH2μgChl-1·h-1,是纯藻培养体系的3.8倍；衣藻cc503与根瘤菌共培养产氢后,体外氢化酶最高活性约为62.8nmolH2μgChl-1·h-1,比未加入根瘤菌的体系提高2.4倍,体内氢化酶最高活性约为21.9nmolH2μgChl-1·h-1,是纯藻培养体系的2.1倍。6.在藻菌共培养产氢体系中,衣藻细胞内淀粉含量明显增加,这是导致藻菌共培养后衣藻产氢量提高的另一个原因：转基因藻hemHc-lbac与根瘤菌共培养产氢后,淀粉最高含量为7.23μg/ml,是纯衣藻体系淀粉含量0.87μg/ml的8.3倍；衣藻cc124与根瘤菌共培养产氢后,淀粉最高含量为13.01gg/ml,是纯衣藻体系淀粉含量1.55μg/ml的8.4倍；衣藻cc503与根瘤菌共培养产氢后,淀粉最高含量为13.99μg/ml,是纯衣藻体系淀粉含量3.18μg/ml的4.4倍。7.加入根瘤菌后,三种衣藻藻株培养体系内的产氢代谢物的变化是不同的,表明不同藻株的产氢代谢有所差别,也是不同藻株与根瘤菌混合培养的最佳产氢条件不同的原因之一。如：三种衣藻藻株培养体系加入根瘤菌后,与未加入根瘤菌的纯衣藻对照体系相比,培养基中的乙酸含量都逐渐降低；但在转基因藻hemHc-lbac和衣藻cc503的体系中加入根瘤菌后,葡萄糖含量随着时间的增加而降低,最后达到最低值,分别为55μg/ml和119μg/ml,而在衣藻cc124的体系内加入根瘤菌后,葡萄糖含量却逐渐增加,最后达到最高值340μg/ml;在加入根瘤菌后,上述三种衣藻藻株的培养体系内的甲酸和乙醇含量都增加,最后甲酸达到最高值依次分别为261.16μg/ml.307.12μg/ml和393.80μg/ml,乙醇的最高值分别为281μg/ml.213μg/ml和150μg/ml。综上所述：根瘤菌与不同衣藻藻株共培养都能显著促进衣藻产氢,表明衣藻与根瘤菌共培养提高产氢的现象具有普遍性；从共培养的开始至产氢高峰阶段,根瘤菌向衣藻聚集生长、形成“团聚物”,且二者的生长都得到促进,细胞内淀粉含量也增加,表明二者间存在阶段性互惠共生现象；本研究还揭示了在根瘤菌与衣藻共培养系统中,只有衣藻产氢,而根瘤菌不产氢；二者共培养使得体系内耗氧速度加快,是根瘤菌促进衣藻产氢的主要原因；其次,共培养体系内二者细胞数增加和淀粉含量增加是导致衣藻产氢增加的另一个重要原因。本研究首次从生理生态学角度揭示了根瘤菌与衣藻共培养过程中二者的相互作用关系和产氢量提高的原因,为进一步深入开展衣藻产氢的代谢调控、拓展根瘤菌的寄主范围以及利用基因工程手段构建高效产氢藻株等研究奠定了理论和实验基础。
【作者】许丽丽；
【导师】李德志；吴双秀；
【作者基本信息】华东师范大学，生态学，2014，博士
【关键词】莱茵衣藻；慢生大豆根瘤菌；生物制氢；互惠共生；呼吸耗氧；生物量；氢化酶活性；代谢产物；

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