熊去氧胆酸在土三七诱导的小鼠肝窦阻塞综合征中的防治作用及机制探讨

【摘要】第一章土三七诱导小鼠肝窦阻塞综合征模型的建立及评价目的：分别用土三七、云南三七、野百合碱(MCT)、环磷酰胺(CTX)、四种药物诱导小鼠HSOS模型,并用磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组。对各模型组进行比较,以寻求高成功率且稳定的造模方法,为进一步探讨HSOS发病机制提供模型基础。方法：135只小鼠随机分为五组：土三七组、云南三七组、野百合碱组、环磷酰胺组、和PBS对照组。分别予以野百合碱灌胃7天,土三七、云南三七、环磷酰胺或PBS灌胃30天后处死小鼠。检测血清中血常规及肝功能指标,留取肝组织行HE染色、Masson染色,用修改后的Deleve评分标准进行病理学评分。结果：1.土三七组、野百合碱组和环磷酰胺组分别有24只、23只和5只小鼠成模,PBS对照组和云南三七组小鼠无一成模。2.与PBS对照组比较,土三七组及野百合碱组小鼠WBC计数较正常组升高,RBC、PLT较正常组明显降低(P<0.05)；环磷酰胺组小鼠WBC、RBC及PLT计数均较正常组有所下降(P<0.05)；各成模小鼠肝重/体重、ALT、AST、TBIL、DBIL均明显升高,ALB明显降低(P<0.05)。3.根据修改后的Deleve评分标准,土三七组及环磷酰胺组成模小鼠多表现为中、重度HSOS,而野百合碱成模小鼠多表现为轻、中度HSOS。结论：土三七、野百合碱及环磷酰胺均能诱导小鼠HSOS模型云南三七未能诱导出HSOS模型。土三七诱导的小鼠HSOS模型成模率达80%,且多为慢性模型,是进一步研究HSOS发病机制及防治措施的更为理想的模型。第二章熊去氧胆酸对土三七诱导的小鼠肝窦阻塞综合征防治作用的观察目的：探讨不同剂量熊去氧胆酸对土三七诱导的小鼠HSOS的预防性治疗作用。方法：115只小鼠随机分为PBS对照组、土三七组、低剂量熊去氧胆酸干预组(15mg/kg/d)和高剂量熊去氧胆酸干预组(30mg/kg/d),灌胃30天后处死小鼠。留取血清及肝组织。测肝重/体重；检测血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALB水平；对肝组织进行HE染色和Masson染色,用修改后的Deleve评分标准进行病理学评分；并用免疫组织化学法检测肝组织纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)的表达水平。结果：1.土三七组、低剂量熊去氧胆酸干预组和高剂量熊去氧胆酸干预组各有24只、7只、4只小鼠发生HSOS。与土三七组比较,各干预组小鼠肝重/体重,血清ALT、AST、TBIL、DBIL有所下降,ALB有所升高,其差异有统计学意义(P<0.05),以高剂量干预组改善更为明显。2.各组小鼠肝脏病理评分结果：根据修改后的Deleve评分标准,土三七组小鼠多表现为中、重度HSOS;低剂量熊去氧胆酸干预组多表现为轻中度HSOS,仅1只为重度；高剂量熊去氧胆酸干预组4只成模小鼠均表现为轻中度HSOS。3.肝组织PAI-1免疫组化结果：土三七组小鼠肝组织中PAI-1表达水平较正常对照组明显增高。与土三七组比较,各干预组PAI-1表达水平均明显降低(P<0.05),以高剂量干预组下降更为明显,两干预组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.熊去氧胆酸对土三七诱导的小鼠HSOS有一定的防治作用,能减轻小鼠的临床症状、改善其肝功能,减轻病理损害程度。高剂量熊去氧胆酸组的防治效果较低剂量组更为明显。2.各组小鼠肝组织中PAI-1表达水平与肝脏的病变轻重相关,提示PAI-1可作为HSOS病情严重程度和疗效的监测指标。第三章熊去氧胆酸对土三七诱导的小鼠肝窦阻塞综合征防治机制的探讨目的：通过检测和比较熊去氧胆酸干预对土三七诱导的HSOS小鼠肝组织NTrf2/ARE通路的影响,探讨熊去氧胆酸保护作用的可能机制。方法：115只小鼠随机分为PBS对照组、土三七组、低剂量熊去氧胆酸干预组(15mg/kg/d)和高剂量熊去氧胆酸干预组(30mg/kg/d),灌胃30天后处死所有小鼠。检测各组小鼠肝组织8-OHGD、MDA、GSH、SOD水平,应用RT-PCR法检测各组肝组织Nrf2、SOD、γ-GCSmRNA水平；免疫蛋白印迹杂交法(Westernblot)检测肝脏组织γ-GCS及胞浆、胞核Nrf2蛋白表达水平,并比较各组Nrf2的DNA结合活性。结果：1.与PBS对照组比较,三个药物干预组8-OHGD、MDA水平显著增高(P<0.01),GSH、SOD水平显著降低(P<0.01或P<0.05)；两个熊去氧胆酸干预组8-OHGD、MDA水平明显低于土三七组(P<0.01或P<0.05),GSH、SOD水平则明显高于土三七组(P<0.01或P<0.05)2.与PBS对照组比较,三个药物干预组SOD、γ-GCSmRNA水平均明显增高(P<0.01),Nrf2mRNA水平各组间无明显差异；两个UDCA干预组SOD、γ-GCSmRNA水平均高于土三七组(P<0.01或P<0.05),低剂量UDCA干预组与高剂量UDCA干预组组间比较无明显差异。3.与PBS对照组比较,三个药物干预组胞浆γ-GCS、Nrf2蛋白水平均明显增高(P<0.01),两个UDCA干预组y-GCS蛋白水平高于土三七组(P<0.01或P<0.05),而Nrf2蛋白水平则低于土三七组；在胞核内,三个药物干预组Nrf2蛋白水平均高于对照组,两个UDCA干预组胞核内Nrf2蛋白均高于土三七组,两个UDCA干预组胞浆、胞核内Nrf2蛋白水平组间比较均无明显差异；4.与PBS对照组比较,三个药物干预组Nrf2的DNA结合活性均明显增高(P<0.01),两个UDCA干预则高于土三七组(P<0.01或P<0.05),高剂量UDCA干预组高于低剂量组。结论：1.熊去氧胆酸干预可降低土三七诱导的HSOS小鼠肝脏氧化应激损伤,增加肝脏内源性抗氧化物质GSH和SOD水平；2.熊去氧胆酸可能通过促进Nrf2的生成及核移位从而激活Nrf2/ARE通路增加下游内源性抗氧化酶SOD、γ-GCS等的合成进而增加机体抗氧化应激能力来达到防治HSOS的效果,高剂量干预组效果优于低剂量干预组。
【作者】龙利民；
【导师】霍继荣；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】土三七；肝窦阻塞综合征；熊去氧胆酸；核因子相关因子2；

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