高糖影响1,25(OH)_2D_3刺激雪旺细胞分泌神经生长因子能力的研究

【摘要】背景糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见,发病机制最复杂的慢性并发症之一,在我国2型糖尿病发病率高达9.7%,而其中60-70%的患者并发周围神经病变。由于疼痛,麻木,及其继发的糖尿病足感染,截肢,导致患者生活质量明显下降和医疗费用明显增加。1,25(OH)2D3是维生素D3的体内活性代谢物,近期流行病学及临床研究显示,维生素D3不足与糖尿病周围神经病变密切相关,维生素D3的不足是糖尿病周围神经病变独立的危险因素。美国健康与营养调查研究(NHANES)的最新统计数据表明,81%的成人糖尿病患者存在维生素D3不足,且与糖尿病神经病变密切相关,即使避开人口统计因素,肥胖,并发症,神经病变药物治疗和糖尿病病程这些可能的混杂因素,这一关系仍然存在。在一项对210名糖尿病患者的临床研究中,神经病变组25-羟维生素D3(25(OH)D3:维生素D3体内活性物质的检测指标)水平比无神经病变组低,神经病变组和无神经病变组患者25(OH)D3缺乏分别占81.5%和60.4%。一项对于糖尿病痛性神经病变和维生素D3关系的前瞻性研究显示：51名痛性神经病变的糖尿病患者,均存在维生素D3不足,平均血浆25(OH)D3浓度为18ng/mL.疼痛评分与25(OH)D3浓度呈负相关。维生素D3充足后,疼痛评分明显下降。但是1,25(OH)2D3与糖尿病神经病变之间的关系尚不清楚。随着近年来对1,25(OH)2D3研究的进一步深入,其对中枢神经胶质细胞-星状细胞的保护作用已得到证实：1,25(OH)2D3抑制诱导型一氧化氮合成酶表达,减少一氧化氮的合成,减少细胞炎性反应；能增加星状细胞神经生长因子mRNA及蛋白表达,介导神经营养保护作用；增加星状细胞细胞外谷胱甘肽池,并明显减少脂多糖介导的亚硝酸盐产生,清除活性氧物质。但目前关于1,25(OH)2D3对周围神经系统影响,尤其是与雪旺细胞之间关系的研究较少。雪旺细胞(SchwanncellSC)在周围神经系统具有重要作用,例如：髓磷脂的形成,支持,营养,促进轴突和神经元的恢复,分泌多种神经营养因子(例如：神经生长因子(nervegrowthfactorNGF))。神经生长因子在周围神经病变神经再生中具有重要地位,降低的神经生长因子水平一定程度上导致了轴突再生失败及糖尿病周围神经病变的发病。高糖条件下,下降的神经生长因子水平降低了背根神经节神经元的出芽。许多研究显示1,25(OH)2D3介导多种细胞神经生长因子的表达,虽然仅有一篇文章报道其上调雪旺细胞神经生长因子基因表达,1,25(OH)2D。与糖尿病神经病变的关系是否也与1,25(OH)2D3介导雪旺细胞神经生长因子的分泌有关,虽然目前尚没有研究直接提及其对雪旺细胞神经生长因子分泌水平的影响。然而已经有动物研究在一定程度上支持了我们的设想,糖尿病大鼠坐骨神经神经生长因子减少,维生素D3的衍生物能剂量依赖性地增加其神经生长因子产生,防止神经生长因子的耗竭。然而,为什么高糖状态会引起神经纤维产生的神经生长因子减少,这与1,25(OH)2D3减少之间是否存在关系?1,25(OH)2D3通过维生素D受体,结合维甲酸x受体或经过ERK1等信号分子途径,激活CYP24A1基因表达,25(OH)D3-24羟化酶(CYP24A1)能将1,25(OH)2D3或25(OH)D3代谢成为没有活性的1,24(OH)2D3或24(OH)。已有研究显示CYP24A1在糖尿病动物模型的肾脏中表达增加。在多种肿瘤细胞中,发现增高的CYP24A1表达,明显地减少了1,25(OH)2D3对肿瘤细胞的抗增殖作用,而给予CYP24A1抑制剂,能增加1,25(OH)2D3的抗肿瘤增殖作用。根据以上数据,我们假设：高糖可能通过影响CYP24A1基因的表达,干扰1,25(OH)2D3正常代谢,.从而导致1,25(OH)2D3介导的雪旺细胞神经生长因子分泌功能的紊乱,影响神经纤维的正常或损伤状态下的生理病理功能。我们首先明确高糖及或1,25(OH)2D3是否影响雪旺细胞神经生长因子的分泌,雪旺细胞上是否存在代谢酶CYP24A1或其他合成酶如：CYP27A1及CYP27B1的表达,在高糖作用下,这些1,25(OH)2D3的代谢基因会有怎么的变化,是否参与到高糖与1,25(OH)2D3的关系中,是否影响雪旺细胞神经生长因子分泌。我们将以大鼠RSC96雪旺细胞作为研究模型,探讨高糖与1,25(OH)2D3对雪旺细胞分泌神经生长因子的影响,以及二者之间的相互作用关系。第一部分高糖及1,25(OH)2D3对雪旺细胞神经生长因子分泌水平的影响目的：研究高糖及1,25(OH)2D3对RSC96雪旺细胞神经生长因子分泌水平的影响。方法：1)高糖对雪旺细胞神经生长因子分泌的影响：将雪旺细胞分别培养在含5.6mmol/L葡萄糖(5.6G),17mmol/L葡萄糖(17G)和17mmol/L甘露醇(17M)DMEM培养基中培养96小时,实验分为三组：①5.6G组②17G组③17M组。应用酶联免疫吸附法(elisa)检测细胞上清液中神经生长因子分泌水平,应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。2)1,25(OH)2D3对雪旺细胞神经生长因子分泌的影响：1,25(OH)2D3(D310-7mol/1)及其相应的乙醇溶质分别作用于含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液中培养的雪旺细胞48小时,实验分成三组：①5.6G组②D3+5.6G组③乙醇+5.6G组。应用酶联免疫吸附法(elisa)检测细胞上清液中神经生长因子分泌水平。应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。3)高糖对1,25(OH)2D3作用的雪旺细胞神经生长因子分泌的影响：雪旺细胞分别在含5,6mmol/L葡萄糖(5.6G),17mmol/L葡萄糖(17G)和17mmol/L甘露醇(17M)DMEM培养基中培养48小时后,加入1,25(OH)2D3(D310-7mol/1)作用48小时,实验分成三组：①5.6G+D3组②17G+D3组③17M+D3组。应用酶联免疫吸附法(elisa)检测细胞上清液中神经生长因子分泌水平。应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。结果：1)给予5.6mmol/L葡萄糖,17mmol/L葡萄糖和17mmol/L甘露醇DMEM培养基培养96小时,雪旺细胞分泌神经生长因子水平没有显著差异(P>0.05)(单因素方差分析F=0.447P=0.648S-N-K两两比较M±SEM5.6G组：177.33±52.40pg/ml17G组：134.56±9.65pg/ml17M组：158.30±15.52pg/mlN=6)。2)1,25(OH)2D3及其相应的乙醇溶质分别作用于含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液中培养的雪旺细胞48小时后,1,25(OH)2D3组神经生长因子分泌水平明显增加(P<0.05)(单因素方差分析F=7.317P=0.006S-N-K两两比较分析M±SEM5.6G组：177.33±52.40pg/mlD3+5.6G组：340.29±30.91pg/ml乙醇+5.6G:161.28±17.90pg/mlN=6).3)雪旺细胞分别在含5.6mmol/L葡萄糖,17mmol/L葡萄糖和17mmol/L甘露醇DMEM培养基中培养48小时后,加入1,25(OH)2D3(D310-7mol/1)作用48小时,高糖组(D3+17G)神经生长因子的水平较其他两组明显降低。(P<0.05)(单因素方差分析F=15.979P=0.000S-N-K两两比较分析M±SEM:D3+5.6G组340.29±30.91pg/mlD3+17G组：151.09±10.43pg/mlD3+17M组：319.05±30.87pg/mlN=6).结论：1)高糖不直接影响雪旺细胞神经生长因子的分泌。2)1,25(OH)2D3增加雪旺细胞神经生长因子的分泌。3)首次发现高糖削弱1,25(OH)2D3刺激雪旺细胞神经生长因子的分泌的能力。第二部分1,25(OH)2D3合成代谢酶基因在雪旺细胞上的表达及高糖对其的影响目的：研究雪旺细胞上是否存在1,25(OH)：D。合成代谢酶基因表达,及高糖是否影响这些酶类的表达,寻找高糖削弱1,25(OH)2D3刺激雪旺细胞神经生长因子的分泌能力的分子机制。方法：1)1,25(OH)2D。合成代谢酶基因引物设计：包括：合成酶25(OH)D3-25羟化酶(CYP27A1),25(OH)D3-1a-羟化酶(CYP27B1)基因,代谢酶：25(OH)D3-24羟化酶(CYP24A1)基因。CYP27A1上游引物5’-AGCCCTCTACACAGATGCCTTAAC-3’,下游引物5’-CCCAGTTATTCATGTATCGCTTCC-3’.退火温度57.5℃,PCR产物长度314bp;CYP27B1上游引物5’-TACGCTCTCCTGGGCACTCTATGA-3’下游引物5’-AAGCGTCTCCCTATGCAACTTCGTT-3’,退火温度57.5℃,PCR产物长度408bp。CYP24A1上游引物5’-GCAGTGGACGACCGCGAACA-3’,下游引物5’-CGATGCACATTCTCTTCCCGATGCC-3’,退火温度60℃,PCR产物长度412bp;β-actin上游引物5’-GAACCCTAAGGCCAACCGTGAA-3’,下游引物5’-CCGCTATTGCCGATAGTGATG-3’,退火温度55℃,PCR产物长度433bp。采用半定量PCR法检测雪旺细胞中是否有以上酶类表达。Fermatas公司RNA试剂盒提取细胞总RNA,Thermo公司试剂盒反转录成CDNA及PCR扩增。PCR反应条件：95℃3min,95℃30s、55℃30s、72℃30s共30个循环,72℃10min。跑胶,成像分析。2)1,25(OH)2D3对其代谢合成酶基因表达的影响：不同浓度1,25(OH)2D3培养雪旺细胞20h,分别检测前述已知基因的表达,每种基因分为三组：①A组：对照组②B组：1,25(0H)2D3(lO-8mol/L)③C组：无水乙醇5μL④D组：1,25(OH)2D3(10-7mol/L)⑤E组：无水乙醇50μL。行半定量RT-PCR检测。实验进行3次。3)高糖对1,25(OH)2D3对其代谢合成酶基因及蛋白表达的影响：17mmol/L葡萄糖分别作用于雪旺细胞20小时及96小时：A：高糖对CYP27A1，CYP27B1及CYP24A1基因的影响：分别检测已知基因的表达量,每种基因都分为六组：①5.6G1组②1761组③17M1组④5.6G4组⑤17G4组⑥17M4组。(①②③代表作用20小时,④⑤⑥代表作用96小时)半定量PCR检测,实验进行3次。B：高糖对CYP24A1蛋白表达的影响：对用半定量PCR法初步筛选表达有变化的基因,用westernblotting方法进一步验证。实验进行3次。4)过氧化氢对CYP24A1基因及蛋白的影响：0.8mmol/L的过氧化氢作用于雪旺细胞20小时,A：过氧化氢对CYP24A1基因的影响：分为两组：①5.6G组②5.6G+H2O2组。行半定量RT-PCR检测,实验进行3次。B.过氧化氢对CYP24A1蛋白的影响：用westernblotting方法进一步验证,实验进行3次。结果：1)雪旺细胞存在CYP27A1,CYP27B1,CYP24A1基因表达2)1,25(OH)2D。增强CYP24A1基因的表达：PCR电泳图进行研究基因/β-actin灰度值分析,行单因素方差分析,1,25(OH)2D。作用20小时后,呈剂量依赖性增强CYP24A1基因表达。F值：118.237P=0.000,B组(M±SEM0.99±0.07N=3),D组(M±SEM1.87±0.07N=3)与其他三组(M±SEMA组：0.52±0.05;C组：0.47±0.04;E组：0.46±0.05N=3)间比较有显著差异(S-N-K)。3)高糖上调CYP24A1基因及蛋白表达：A.17mmol/L高糖增加CYP24A1基因表达,对CYP27A1及CYP27B1基因表达没影响：①PCR电泳图进行研究基因/β-actin灰度值分析,行单因素方差分析,高糖作用20小时及96小时后,CYP27A1及CYP27B1的F值分别为0.66及0.369,两者均P>0.05,因此,17mmol/L高糖不影响雪旺细胞CYP27A1及CYP27B基因的表达。②PCR电泳图进行研究基因/β-actin灰度值分析,行单因素方差分析,高糖作用20小时及96小时后,CYP24A1基因表达增强。F值：15.261P=0.000(M±SEM5.6G1组0.07±0.01：17G1组0.15±0.01；17M1组0.06±0.02；5.6G4组0.06±0.01；17G4组0.14±0.01；17M4组0.06±0.02N=3)。B：高糖上调CYP24A1蛋白的表达：17G组CYP24A1蛋白表达明显高于其他两组(P<0.05)单因素方差分析F=6.706P=0.030(S-N-K两两比较M±SEM5.6G组：0.40±0.0517G组：0.82±0.1117M组：0.44±0.09N=3)。4)过氧化氢对雪旺细胞CYP24A1基因及蛋白表达的影响：A.过氧化氢降低雪旺细胞CYP24A1基因表达：0.8mmol/L的过氧化氢作用雪旺细胞20小时后,检测雪旺细胞CYP24A1基因表达。PCR电泳图用CYP24A1/β-actin灰度值分析。结果显示：过氧化氢降低雪旺细胞CYP24A1的基因表达。两独立样本T-检验(t=7.881,P=0.001)(M±SEM5.6G组：0.29±0.01;5.6G+H202组：0.14±0.02N=3)。B.过氧化氢不影响雪旺细胞CYP24A1蛋白表达：0.8mmol/L的过氧化氢作用雪旺细胞20小时后,检测雪旺细胞CYP24A1蛋白表达。凝胶电泳图用CYP24A1/β-actin灰度值分析。结果显示：过氧化氢不影响雪旺细胞CYP24A1的蛋白表达。两独立样本T-检验(t=0.445,P=0.679)(M±SEM5.6G组：0.40±0.05;5.6G+H202组：0.36±0.07N=3)。结论：1)首次发现雪旺细胞表达CYP27A1,CYP27B1,CYP24A1基因,表明雪旺细胞是1,25(OH)2D3的靶细胞。自身可能具有合成活性维生素D3代谢产物的能力,可能通过自分泌及旁分泌的方式增加局部1,25(OH)2D3浓度,进而影响自身及周围细胞组织。2)首次发现高糖上调CYP24A1基因及蛋白表达,这种CYP24A1基因及蛋白的上调可能干扰1,25(OH)2D3在雪旺细胞的正常分解代谢功能,从而导致对1,25(OH)2D。正常生理功能的影响。3)高糖引起CYP24A1基因及蛋白表达增加,可能与活性氧物质无关。第三部分CYP24A1抑制剂对高糖培养下1,25(OH)2D3介导的雪旺胞神经生长因子分泌能力的影响目的：研究CYP24A1抑制剂是否影响高糖培养下1,25(OH)2D3介导的雪旺细胞神经生长因子分泌的能力方法：CYP24A1抑制剂genistein对高糖培养下的雪旺细胞CYP24A1蛋白的抑制情况：雪旺细胞培养在含17mmol/L葡萄糖的培养液中48小时后,给予genistein(Gen50μmol/1)及其溶质二甲基亚砜(DMSO)作用48小时,实验分2组：①17G+Gen组②17G+DMSO组。应用westernblotting检测CYP24A1蛋白表达。实验进行3次。2)Genistein对高糖作用下1,25(OH)2D3介导的雪旺细胞神经生长因子分泌的影响：雪旺细胞培养在含17mmol/L葡萄糖的培养液中48小时后,给予1,25(OH)2D3和genistein或DMSO作用48小时,实验分为2组：①D3+17G+Gen组②D3+17G+DMSO组。用ELISA检测神经生长因子蛋白的表达水平。应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。结果：1)Genistein降低雪旺细胞CYP24A1蛋白表达：雪旺细胞培养在含17mmol/L葡萄糖的培养液中48小时后,给予genistein或DMSO作用48小时,凝胶电泳图用CYP24Al/β-actin灰度值分析,两独立样本T检验t=-3.030,P=0.039,17G+Gen组CYP24A1的表达明显低于17G+DMKO组。(Mean±SEM17G+Gen组：0.55±0.0417G+DMSO组：0.83±0.09N=6)。2)Genistein增加高糖培养下1,25(OH)2D3介导的雪旺细胞神经生长因子的分泌水平：雪旺细胞培养在含17mmol/L葡萄糖的培养液中48小时后,给予1,25(OH)2D3和genistein或DMSO作用48小时,两独立样本T检验t=2.599,P=0.027,D3+17G+Gen组神经生长因子的分泌明显高于对照组(Mean±SEMD3+17G+Gen组;446.53±68.61Pg/mlD3+17G+DMSO组：242.38±38.25Pg/mlN=6)。结论：1)首次发现Genistein抑制高糖上调的雪旺细胞CYP24A1蛋白的表达。2)首次发现Genistein能够恢复高糖作用下,1,25(OH)2D3介导雪旺细胞分泌神经生长因子水平的能力。第四部分慢病毒介导shRNA沉默CYP24A1基因雪旺细胞模型的构建目的：建立慢病毒介导shRNA沉默CYP24A1基因雪旺细胞模型。方法：应用慢病毒包装shRNA,沉默雪旺细胞的CYP24A1基因：根据公司合成的4个shRNA载体(CYP24A1-1,CYP24A1-2,CYP24A1-3,CYP24A1-4)及阴性(空载体),空白对照(没有处理的雪旺细胞),分为6组：①CYP24A1-1②CYP24A1-2③CYP24A1-3④CYP24A1-4⑤阴性对照(NC组)⑥空白对照(BC组)。实验分为以下几个步骤：1)构建CYP24shRNA载体2)质粒扩增与抽提3)质粒转染,利用westernblot,PCR技术筛选有效载体4)慢病毒包装5)细胞模型制作6)利用westernblot,PCR技术进行干扰效果检测。结果：1)筛选CYP24A1-4慢病毒载体作为转染的有效载体。2)293Ta细胞成功包装慢病毒。3)慢病毒成功感染雪旺细胞,并且沉默了CYP24A1基因和蛋白。结论：慢病毒介导shRNA沉默CYP24A1基因雪旺细胞模型建立。第五部分慢病毒介导RNA干扰沉默CYP24A1基因对高糖培养下1,25(OH)2D3介导雪旺细胞神经生长因子分泌的影响目的：通过沉默CYP24A1基因的雪旺细胞证明高糖对1,25(OH)2D。介导雪旺细胞神经生长因子分泌的影响与CYP24A1上调有关。方法：1)CYP24A1基因沉默对雪旺细胞神经生长因子分泌水平的影响：普通RSC96雪旺细胞(5.6G组)与CYP24A1基因沉默雪旺细胞(si5.6G组)均培养在含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养基中96小时。分为两组：①5.6G组②si5.6G组(siRNA干扰组)。用ELISA检测神经生长因子蛋白的表达水平。应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。2)CYP24A1基因沉默对1,25(OH)2D3介导雪旺细胞神经生长因子分泌水平的影响：1,25(0H)2D3(D310-7mol/1)及其相应的乙醇溶质分别作用于含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液中培养的雪旺细胞和CYP24A1基因沉默的雪旺细胞48小时。分为四组：①5.6G+D3组②5.6G+ET组③si5.6G+D3组④si5.6G+ET组。用ELISA检测神经生长因子蛋白的表达水平。应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。3)CYP24A1基因沉默对高糖作用下1,25(OH)2D3介导的雪旺细胞神经生长因子分泌水平的影响：普通RSC96雪旺细胞(5.6G组)与CYP24A1基因沉默雪旺细胞(si5.6G组)均分别培养在含17mmol/L葡萄糖(17G)或17mmol/L甘露醇(17M)DMEM培养基48小时,再加入1,25(OH)2D3(D310-7mol/1)作用48小时,分别将实验分为四组：①17G+D3组②17M+D3组③si17G+D3组④si17M+D3组。用ELISA检测神经生长因子蛋白的表达水平。应用酶标仪检测吸光度,得出OD值,每次实验设置3个复孔,实验进行2次。结果：1)雪旺细胞CYP24A1基因沉默不影响雪旺细胞正常神经生长因子分泌：两独立样本T检验分析,两组间没有显著差异,T=0.931,P=0.374(Mean+SEM,5.6G组：162.08±4.13；si5.6G组：156.76±3.95N=6)。2)CYP24A1基因沉默增加1,25(OH)2D3介导雪旺细胞神经生长因子分泌水平：经单因素方差检验分析,F=22.971,P=0.000,si5.6G+D3组较其他三组增加。(Mean±SEM,5.6G+D3组：238.17±7.26；5.6G+ET组：201.16±5.28；si5.6G+D3组：278.83±9.5:si5.6G+ET组：204.56±7.55,N=6)。3)CYP24A1基因沉默减少了高糖对1,25(OH)。D3介导雪旺细胞神经生长因子分泌的影响：17G作用下基因沉默组比普通细胞组神经生长因子分泌明显增加,两独立样本T-检验,t=-8.807,P=O.000(Mean±SEM17G组：145.49±6.75；si117G组：238.28±7.57;N=6)；将17G作用下及其对照17M作用下,神经生长因子的分泌水平的差异做比较,CYP24A1基因沉默雪旺细胞比普通雪旺细胞差异显著减少。提示CYP24A1基因沉默后,高糖对1,25(OH)2D3介导的雪旺细胞神经生长因子分泌的影响明显降低了。两独立样本T检验分析,t=4.371p=O.001(Mean±SEM17M-17G组：92.79±5.49:si17M-17G组：33.50±12.4;N=6)。结论：1)CYP24A1基因沉默不影响雪旺细胞神经生长因子分泌。2)CYP24A1基因沉默增加1,25(OH)2D3介导雪旺细胞神经生长因子的分泌水平。3)CYP24A1基因沉默减少了高糖对1,25(OH)2D3介导雪旺细胞神经生长因子分泌的影响。证明高糖对雪旺细胞CYP24A1基因及蛋白的上调,在高糖对1,25(OH)2D3功能的影响中,确实起到了重要作用。
【作者】周怡昆；
【导师】薛耀明；
【作者基本信息】南方医科大学，内分泌与代谢病学（专业学位），2014，博士
【关键词】高糖；1,25（OH）2D3；雪旺细胞；神经生长因子；CYP27A1；CYP27B1；CYP24A1；Genistein；抑制剂；1,25（OH）2D3神经生长因子；慢病毒载体雪旺细胞；RNA；干扰；基因沉默；

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