维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕影响的实验研究

【摘要】瘢痕(Scar)是机体创伤愈合的必然产物。病理性瘢痕由于瘢痕增生过度,从而引起外形和(或)功能异常。增生性瘢痕(HypertrophicScar,HS)是临床最常见的病理性瘢痕之一,造成患者外观畸形和功能异常,给患者身体及心理带来了较大的影响。由于其具体机制尚不十分清楚,且治疗后易复发等特点,当前尚无较好的防治手段。增生性瘢痕的形成是多环节、多阶段的一个复杂过程,包括凝血、早期炎症、晚期炎症、成纤维细胞的迁移与胶原的合成、血管化、上皮化、重塑阶段等。传统治疗方法包括局部加压、激素注射、硅凝胶类以及放化疗等虽然取得了一定效果,但在治疗HS的同时,会出现副作用或不良反应,临床应用受到一定限制。在传统中医理论中,HS认为是由于气血壅滞、经络痹阻、痰湿搏结或三者联合所致,且基于活血化瘀、攻毒散结、通络止痛、酸涩收敛和消结散瘢等方法在增生性瘢痕的防治上取得了一定进展。虽然目前报道的中医治疗瘢痕的方法很多,但多数存在用药途径比较单一、剂型有限、多集中在单味药物或是提取物研究等缺陷,且疗效不确切,容易复发等缺点。维医理论认为体液是人类生命及生理活动过程的基本物质体内各种营养物质在肝中产生的各种液体总称为体液,分为胆液质、血液质、粘液质和黑胆质四种。它们贯穿于整个人生,在体内自然形成,对健康和疾病起很大的作用。它们在体内不断地消耗,又不断地产生,保持着一定的平衡状态。四体液脱离自然的正常状态,在数量和质量上发生改变,成为对人体无益或有损的体液,称为异常体液。在体内外各种因素的作用下,人体内胆质体液的量增加,功能改变,在机体基础“热”的作用下“燃烧”最终形成异常黑胆质,是许多疾病维吾尔医学病理生理上所共有的特性。治疗上主要采用异常黑胆质成熟剂(AbnormalSavdaMunziq,ASMq)进行调整。ASMq在防治部分肿瘤、糖尿病、高血压等方面均取得了一定效果。体外研究显示ASMq具有抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡等作用。研究表明皮肤增生性瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质胶原过度沉积所引起,又被称为“皮肤成纤维细胞良性肿瘤”。本研究在传统维医理论指导下提出科学假设：皮肤增生性瘢痕是异常黑胆质体液在皮肤的局部沉积所致,是全身异常黑胆质体液的局部表现。本研究拟通过兔耳增生性瘢痕动物模型以及体外人增生性瘢痕成纤维细胞培养实验,通过采用不同浓度ASMq干预研究,来检验假设,并进一步探讨其细胞与分子机制。研究表明,增生性瘢痕是由于成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质胶原过度沉积所引起,其中TGF-p是导致增生性瘢痕形成的重要细胞因子,它主要通过TGF-β/Smad信号通路参与调节成纤维细胞的增殖,凋亡,迁移和胶原代谢。TGF-β能同时触发两个可以对抗Smad蛋白介导的正反馈调节机制,其中就是快速激活Smad7启动子,诱导Smad7基因表达,通过Smad7竞争性的占据TGF-βI型受体,抑制受体的蛋白激酶R-TGF-p的磷酸化而阻断信号传导,最后诱发它能促进细胞外基质在伤口沉积,并能促进纤维化,促使形成增生性瘢痕。由于增生性瘢痕是成纤维细胞过度增殖和细胞外胶原机制过度沉积而引起,因此抑制成纤维细胞增殖、抑制其胶原表达是防治增生性瘢痕的基础。在细胞水平上,通过抑制细胞活性从而抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡可以减少瘢痕内成纤维细胞数量,可以在一定程度上防治增生性瘢痕；在细胞超微结构中,改变细胞内内质网、核糖体、线粒体等与胶原表达关系密切的亚细胞器活性可以在一定程度上具有减少瘢痕胶原的沉积的作用;在蛋白分子水平上,由于TGF-β/Smad信号通路是胶原产生的主要通路之一,且TGF-β1是促进细胞增殖的重要因子之一,因此通过减少TGF-β1的表达、增加Smad7的表达可以防治增生性瘢痕的发生和发展。目的：通过体内体外实验初步探讨维药ASMq对增生性瘢痕的影响及其作用机制,为临床采用维医维药理论防治增生性瘢痕提供实验和理论依据。方法：本研究采用兔耳瘢痕动物模型、体外增生性瘢痕成纤维细胞培养等途径,分别从组织学、细胞学以及分子生物学水平,探讨维药ASMq对增生性瘢痕的影响及其作用机制。第一部分,体内实验部分,灌胃给予维药ASMq对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究。20只新西兰大耳白兔采用随机数字表法随机分为4组,即空白对照组(生理盐水)三个实验组分别为：(ASMq400mg/kg),(ASMq800mg/kg)、(ASMq1200mg/kg),每组5只。在创面形成后第45天(预实验表明此时瘢痕增生达到峰值),分别取材后进行各项指标测定,备好切片后进行四项实验实施。(1)通过计算瘢痕增生指数(HypertrophicIndes,HI),与空白对照组相比,从而明确各实验组ASMq对兔耳增生性瘢痕有无影响。(2)通过对各组创面范围内组织切片行HE染色,观察各组兔耳瘢痕胶原排列以及成纤维细胞密度等情况,进一步明确ASMq对兔耳增生性瘢痕胶原增生以及成纤维细胞增殖的影响。(3)通过对各组创面范围内组织行Masson染色,观察各组胶原排列以及胶原密度,通过采用单因素方差分析分析多组间胶原面密度,通过两两比较q检验,明确各组间胶原面密度有无差异。(4)通过对兔耳创面范围内组织标本通过透射电镜观察组织超微结构(包括原胶原纤维、线粒体、内质网等细胞亚结构),通过与空白对照组相比较分析,初步在超微结构层面进一步观察不同浓度维药ASMq对兔耳增生性瘢痕的影响机制。第二部分,体外实验,通过体外分离培养人增生性瘢痕来源成纤维细胞,分四组(1个空白对照组,3个实验组)：空白对照组,低浓度ASMq组(0.1mg/m1),中浓度ASMq组(0.4mg/m1),高浓度ASMq组(0.7mg/m1)。对各组在相应时间点收集标本进行检测：(1)通过CCK-8方法,采用酶标仪检测ASMq对成纤维细胞体外增殖有无影响。(2)采用细胞凋亡分析试剂盒通过流式细胞分析仪行细胞凋亡检测,拟明确不同浓度ASMq对成纤维细胞凋亡的影响。(3)采用细胞周期检测试剂盒,通过流式细胞术分析ASMq对成纤维细胞细胞周期的影响,拟明确ASMq阻断细胞增殖周期的具体时间点。(4)通过细胞划痕迁移实验观察成纤维细胞迁移能力,拟明确不同浓度ASMq对成纤维细胞迁移能力有无影响。(5)通过透射电镜观察成纤维细胞合成原胶原能力以及内质网、核糖体、细胞核、线粒体等细胞亚结构情况,拟明进一步分析明确不同浓度ASMq对成纤维细胞表达胶原以及细胞凋亡、增殖的机制。第三部分,采用RT-PCR方法和免疫印迹等方法基于TGF-β/Smad通路分析ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞细胞增殖、胶原表达影响的分子机制。拟明确不同浓度ASMq对增生性瘢痕来源成纤维细胞细胞增殖、胶原表达的分子机制。结果：第一部分,体内兔耳增生性瘢痕动物模型实验结果表明,灌胃给药ASMq可以在一定程度上抑制增生性瘢痕的发生发展,且在一定浓度范围内具有浓度梯度依赖性。(1)大体观察结果,增生性瘢痕的厚度随着ASMq的浓度逐渐增大,其厚度逐渐减小,硬度逐渐软化,体积逐渐减小趋于平复,颜色逐渐变淡。(2)计算瘢痕增生指数结果,与空白组(3.87±0.22)对比,实验各组分别为(3.38±0.34)、(2.63±0.15)、(1.72±0.12)增生性指数(HI)随着ASMq的浓度逐渐增加而降低(p<0.05)。(3)通过HE染色在1200mg/kg浓度维药ASMq灌胃后对瘢痕增生的成纤维细胞密度观察结果,与空白组(4022.5±±189.3)相比,实验组(3541.44±206.6)的显示瘢痕增生不明显,成纤维细胞数量及密度减少(p<0.05)。(4)通过Masson染色在1200mg/kg浓度维药ASMq灌胃后对瘢痕增生的胶原纤维情况观察结果,与空白组(42.25±2.58)相比,实验组(23.55±1.28)的增生性瘢痕胶原纤维面密度明显减少(p<0.05)。(5)通过透射电镜观察不同浓度的ASMq对增生性瘢痕成纤维细胞的超微结构观察结果;与空白组对比,随着实验组浓度的递增成纤维细胞密度和胶原纤维面密度逐渐减少。第二部分,体外增生性瘢痕来源成纤维细胞干预实验结果表明,在一定浓度范围内ASMq具有抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡的作用；细胞超微结构分析结果显示ASMq具有抑制成纤维细胞原胶原合成,抑制细胞亚结构(如内质网、核糖体、线粒体等)活性,促进细胞凋亡等作用。生物学特性的影响。(1)体外细胞培养原代和传代及细胞冻存和复苏情况结果,成纤维细胞界限清楚,胞体较大,呈棱形或不规则三角形,细胞质向外伸出两三个长短不同的突起,胞浆丰富、胞膜边界清晰、核仁多以成双出现大小均等。(2)用CCK-8法检测各组HSFs增殖活性结果,与空白对照组相比,不同浓度ASMq组以及阳性对照组5-Fu组的HSFs增值活性明显降低,其差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)用流式细胞技术检测各组HSFs细胞凋亡结果,与空白对照组凋亡率为2.2%±0.59%,不同浓度ASMq实验组凋亡率分别为14.1%±3.87%,23.5%±3.22%,38.8%±3.14%,43.7%±2.58%；ASMq组凋亡率明显高于对照组,且凋亡率随ASMq浓度增加呈递增趋势。(4)ASMq对HSFs细胞周期的影响结果,与空白对照组比较,不同浓度ASMq组HSFs在G2/M期细胞比例呈不同程度升高,具有浓度依赖性,即在0.1-1.0mg/ml浓度间,随着ASMq浓度增加,GR/M期细胞比例从13.1%增加到29.5%,差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)ASMq干预增生性瘢痕来源的成纤维细胞迁移实验结果。与空白组相比,实验组分别在0h、24h、48h后,增生性瘢痕的成纤维细胞迁移能力随着时间的延长而逐渐减弱(p<0.05)。(6)ASMq对HSFs超微结构的影响结果,从低倍和高倍镜观察到：0.4mg/ml组的成纤维细胞的细胞核消失；0.7mg/ml组成纤维细胞膜出现收缩;1mg/ml组成纤维细胞出现凋亡小体相对空白组。第三部分,通过体外对不同浓度ASMq干预后的增生性瘢痕来源成纤维细胞基于TGF-β/Smad通路分析,结果显示ASMq可以抑制TGF-β1的表达,促进抑制型Smad7的表达。在分子生物水平方面,通过RT-PCR的检测方法和western-blot检测方法。(1)ASMq对成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的影响结果,与空白组对比,AMSq随着药物浓度的增加,TGF-β1mRNA表达量减少(P<0.05)。(2)ASMq对成纤维细胞Smad7mRNA表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加Smad7mRNA表达量增加(P<0.05)。(3)ASMq对成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加,TGF-β1蛋白表达量减少(P<0.05)。(4)ASMq对成纤维细胞Smad7蛋白表达的影响结果,与空白组对比,ASMq随着药物浓度的增加Smad7蛋白表达量增加(P<0.05)。结论：灌胃给药ASMq可以在一定程度上抑制兔耳增生性瘢痕的发生发展,且在一定浓度范围内具有浓度梯度依赖性,其通过抑制胶原合成和成纤维细胞增殖途径发挥作用。在一定浓度范围内,ASMq具有抑制人增生性瘢痕来源成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡的作用；细胞超微结构分析结果显示ASMq具有抑制成纤维细胞原胶原合成,抑制细胞亚结构(如内质网、核糖体、线粒体等)活性,促进细胞凋亡等作用。ASMq可以抑制人增生性瘢痕来源成纤维细胞TGF-p1的表达,促进抑制型Smad7的表达。综上表明ASMq可以基于TGF-β/Smad通路抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制胶原表达,从而抑制增生性瘢痕的发生发展,为增生性瘢痕的防治提供了新的思路。
【作者】王虎军；
【导师】马少林；
【作者基本信息】新疆医科大学，整形外科（专业学位），2013，博士
【关键词】增生性瘢痕；异常黑胆质成熟剂；细胞增殖；胶原；Smad7；

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