可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合骨植入材料的制备与应用研究

【摘要】第一部分可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合材料的制备及性能研究目的采用原位聚合方法制备出可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合材料（nanocalcium-deficienthydroxyapatite/multi(aminoacid)copolymer/calciumsulfatehemihydrate,n-CDHA/MAC/CSH），对其组成与结构进行分析，并探讨不同比例的n-CDHA/MAC和CSH对复合材料注射性能、凝固时间、力学性能等特性的影响，筛选出合适的材料复合比。方法原位聚合法成功制备n-CDHA/MAC复合材料，与CSH粉末按照混合物中n-CDHA/MAC从0%到40%不同比例进行均匀混合后，用双螺杆挤出机在170℃的条件下挤塑复合，挤塑出的复合材料经干冰冷却后用粉碎机粉碎成粒度大小在38μm～125μm范围内的粉末，将复合材料按照合适的固液比混合后，红外光谱及X射线衍射分析其组成与结构；扫描电镜观察其微观结构；采用ISO9579-1989E国际标准检测注射性能及凝固时间；REGER30-50型力学测试机检测其压缩强度。结果红外光谱及X射线衍射分析表明复合前后n-CDHA、MAC、CSH相组成没变，复合材料中不存在其他杂相，各组成成分之间由化学键结合，而非机械结合方式；复合材料的SEM图显示，n-CDHA、MAC及CSH均匀地结合在一起，各材料之间几乎没有粒子脱落导致的空洞，存在着较好的界面结合，复合材料的表面致密、粗糙且富有孔隙；随着n-CDHA/MAC加入比例的增加（10%，20%，30%，40%），n-CDHA/MAC/CSH复合材料的凝固时间延长，注射性能提高；压缩强度检测提示含0wt%、10wt%、20wt%、30wt%、40wt%n-CDHA/MAC的复合材料压缩强度分别为21.24±1.92Mpa、28.42±2.63Mpa、34.34±2.52Mpa、43.92±2.40Mpa、30.77±3.37Mpa，当n-CDHA/MAC含量从0%增长到30%时，复合材料的抗压强度逐渐升高，但到n-CDHA/MAC含量达到40%时，复合材料的压缩强度开始明显降低，材料甚至出现碎裂、崩塌的现象。结论成功制备了可注射性n-CDHA/MAC/CSH复合材料，复合材料各相之间不是简单的物理混合，而是存在一定的化学键合；可以通过调整复合材料中n-CDHA/MAC和CSH的比例来调控其注射性能、凝固时间及机械性能。通过筛选，30%n-CDHA/MAC含量的复合材料符合骨科手术需要。第二部分可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合材料体外细胞相容性研究目的评估可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合材料（nanocalcium-deficienthydroxyapatite/multi(aminoacid)copolymer/calciumsulfatehemihydrate,n-CDHA/MAC/CSH）的细胞相容性及对MC3T3-E1成骨细胞生物学行为的影响。方法实验一：n-CDHA/MAC/CSH复合材料与L929细胞毒性检测:通过直接接触法和浸提液接触法将n-CDHA/MAC/CSH圆片状复合材料与L929细胞共同培养，相差显微镜下观察材料对L929细胞形态学影响；MTT法检测L929细胞增殖度；PE-7AAD双标流式细胞仪检测L929细胞凋亡情况。实验二：n-CDHA/MAC/CSH复合材料对MC3T3-E1成骨细胞生物学行为影响：将MC3T3-E1成骨细胞分别种植于n-CDHA/MAC/CSH、CSH圆片状材料表面，设立空白对照组。SEM观察细胞在材料表面黏附及生长情况；酶联免疫吸附测定法(Elisa)检测材料对成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）及骨钙素(OC)分泌的影响；通过Transwell小室迁移实验检测材料对成骨细胞迁移的影响。结果实验一：直接接触实验表明n-CDHA/MAC/CSH复合材料对L929细胞无明显细胞毒性，细胞形态良好，贴壁生长良好；MTT检测实验组细胞毒性为I级，流式细胞仪检测结果证实n-CDHA/MAC/CSH复合材料对细胞的凋亡率没有明显影响（P>0.05）。实验二：扫描电镜观察提示MC3T3-E1细胞在n-CDHA/MAC/CSH表面及CSH表面生长良好，形态规则，细胞之间紧密连接并随着培养时间的延长呈现出复层生长的现象；Elisa法检测三组细胞分泌ALP在共培养第1天无明显差别（P>0.05），在共培养第4天及第7天，n-CDHA/MAC组ALP水平明显高于CSH组及空白对照组（P<0.05）；OC水平在3、5、7天时各组间无明显差别（P>0.05），在10天时n-CDHA/MAC/CSH复合材料组和CSH组细胞分泌OCN含量高于空白组，在14天时n-CDHA/MAC/CSH复合材料组细胞分泌OC含量明显高于CSH组及空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；Transwell小室迁移实验提示各组之间无明显差异（P>0.05）。结论n-CDHA/MAC/CSH复合材料无明显细胞毒性，具有良好的成骨细胞相容性，对成骨细胞的黏附、生长、增殖及分化具有一定的促进作用。第三部分可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合材料修复兔股骨髁骨缺损研究目的评估可注射性缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙复合材料（nanocalcium-deficienthydroxyapatite/multi(aminoacid)copolymer/calciumsulfatehemihydrate,n-CDHA/MAC/CSH）的生物相容性及修复兔股骨髁骨缺损的能力。方法在新西兰大白兔双侧股骨髁松质骨区域制造直径6.5mm，深1cm的股骨髁骨缺损模型，骨缺损处注射n-CDHA/MAC/CSH复合材料作为实验组，对照组处注射CSH材料，空白组不作任何处理。术后4、8、16周行大体观察、微型CT扫描、硬组织切片及V-G染色，术后4、16周行肝、脾、肾组织学检测以评价材料在动物体内的生物相容性、骨缺损修复能力及生物降解情况。结果手术后各组动物切口愈合良好，未见明显红肿及感染征象。大体观察实验组及对照组骨缺损处皮质在16周时已完全闭合，空白对照组在16时仍可看见明显缺损；微型CT扫描提示实验组与对照组都具有修复股骨髁缺损的能力，但实验组新生骨小梁数量及密度在各个时间点均要高于对照组（P<0.05），对照组则未发现新骨形成征象；硬组织切片提示n-CDHA/MAC/CSH复合材料与新生骨组织紧密结合，16周时材料大部分降解，形成的新生骨小梁成熟而致密；对照组CSH材料在8周时已基本降解，到第16周时新生骨小梁不成熟且稀疏；空白对照组则只看见少许纤维组织，未见新生骨的形成。术后兔肝、脾、肾组织学检测未见明显异常。结论n-CDHA/MAC/CSH复合骨修复材料生物相容性好，与单纯CSH骨水泥相比，具有更加良好的降解速率及修复骨缺损能力，具有良好的临床应用前景。
【作者】祁小桐；
【导师】蒋电明；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】缺钙纳米羟基磷灰石/聚氨基酸/硫酸钙；骨植入材料；可注射性；生物相容性；骨缺损修复；

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