ZHC116的抗炎作用研究

【摘要】第一章MTT法检测ZHC116对NIH3T3细胞增殖的影响研究背景：纤维化是指纤维结缔组织在细胞外大量沉积的过程,可累及多个脏器,严重危害人类健康,目前临床上尚缺乏特效药物治疗。吡啶酮类化合物是新型广谱抗炎、抗纤维化的药物,其代表药物吡非尼酮(Pirfenidone,5-甲基1-苯基2-(1H)吡啶酮),在日本及欧洲已批准用于治疗特发性肺纤维化(IdiopathicPulmonaryFibrosis,IPF)。氟非尼酮(fluorofenidone,AKF-PD)是本课题组独立研发的吡非尼酮的me-better药物,已申请一期临床研究。ZHC116是本课题组新近合成并筛选出来的另一吡啶酮类化合物,较AKF-PD及吡非尼酮,具有效果更强、副作用小、治疗窗广等特点。前期研究证实,ZHC116具有较强的抗纤维化效应。纤维化的发病机制复杂,其中成纤维细胞增殖起重要作用。成纤维细胞是产胶原细胞(即肌成纤维细胞)的主要来源,经活化后可分泌大量一、三型胶原和纤连蛋白,从而导致器官纤维化的发生。MTT比色法,是一种常用的检测细胞增殖的方法,具有简便、快速、易标准化等优点,在国内外已被广泛应用于药物筛选、细胞毒性检测等领域。MTT检测药物对NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)增殖的影响可部分反映药物的抗纤维化效能。目的：检测ZHC116对NIH3T3细胞增殖的影响,探索药物作用的有效浓度范围。方法：以NIH3T3细胞株为研究对象,加入浓度梯度的药物ZHC116(0.05mM、0.1mM、0.15mM.0.20mM),分别孵育48或72小时,MTT法比较各组吸光度值,计算半效抑制浓度(IC50)。结果：0.05mM的ZHC116对NIH3T3细胞无明显抑制作用,在0.10-0.20mM的浓度范围内,随浓度的增高及作用时间的延长,ZHC116对NIH3T3细胞的抑制率逐渐增高。结论：在0.10-0.20mM浓度范围内,ZHC116对NIH3T3细胞的增殖具有抑制作用。第二章ZHC116对内毒素血症小鼠死亡率及炎症因子IL-1β的影响研究背景：本课题组前期研究证实,ZHC116可以减轻肾纤维化模型早期巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润,减轻肾间质损伤,提示潜在的抗炎作用,而其对全身炎症反应的作用不明。内毒素血症是全身炎症反应综合征的经典模型。在脂多糖(LPS)刺激下,大量炎症介质基因过度表达,从而导致过度炎症反应和免疫紊乱。NALP3炎性体是由凋亡相关微粒蛋白(ASC)、caspase蛋白酶以及NOD样受体(NLRP3)组成的复合体,是天然免疫系统的重要组成部分。其能激活caspase-1,活化的caspase-1切割前体IL-1β为成熟体。NALP3.ASC、caspase-1基因敲除对内毒素小鼠具有保护作用。IL-1β是经典的早期炎症因子,亦可作为炎性体活化的标志。我们前期研究发现,AKF-PD能有效改善内毒素血症小鼠的死亡率,并降低IL-1β的水平。而ZHC116在此方面的作用尚待研究。目的：观察ZHC116对内毒素血症模型小鼠死亡率及炎症因子IL-1β的影响。方法：取64只Balb/c小鼠随机分为以下四组：对照组、LPS模型组、ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD(200mg/kg)治疗组。LPS模型组及药物处理组予以LPS(15mg/kg)腹腔注射,同时腹腔内给予药物或等体积的PBS,记录各组小鼠第0-144小时存活只数。另取40只Balb/c小鼠,按同样方式分组,每组10只,药物(或PBS)与LPS同时腹腔注射,2小时后取血,ELISA检测炎症因子IL-1β。结果：144小时内,对照组无小鼠死亡,LPS组死亡率明显升高,达87.5%(死亡数/总数=14/16)；腹腔注射ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD(200mg/kg)均能显著降低内毒素血症小鼠的死亡率,分别为43.75%(7/16,ZHC116组)和31.25%(5/16,AKF-PD组),两组较LPS组,均有统计学差异。两药物治疗组之间无明显差异。LPS腹腔注射2小时后,小鼠血清中IL-1β的浓度明显增高,ZHC116(50mg/kg)及AKF-PD(200mg/kg)治疗后明显下降,两治疗组之间无统计学差异。结论：ZHC116对内毒素血症小鼠具有保护作用,并能降低内毒素血症小鼠血清中IL-1β的水平。ZHC116(50mg/kg)与AKF-PD(200mg/kg)作用相当。第三章ZHC116对腹腔巨噬细胞表达IL-1β及对NALP3炎性体的影响研究背景：腹腔巨噬细胞是内毒素血症的的主要作用细胞。LPS刺激后,腹腔巨噬细胞一方面负责清除细菌病原体及坏死的组织、细胞等。另一方面分泌大量的炎性因子介质(如IL-1β),介导炎症反应。炎性体主要存在于巨噬细胞中,在内毒素血症中介导免疫细胞的死亡和机体的免疫抑制。前一部分的研究发现,ZHC116能降低内毒素血症小鼠血清中IL-1β的水平,但具体作用于IL-1β的合成水平还是通过作用于炎性体影响IL-1β的成熟尚不清楚。目的：探讨ZHC116对LPS诱导腹腔原代巨噬细胞表达和释放IL-1β及对炎性体组分NALP3及caspase-1表达的影响方法：获取小鼠腹腔原代巨噬细胞,分为四组：对照组、LPS刺激组及ZHC116(0.1mM)治疗组。予ZHC116(0.1mM)处理24小时后,予以LPS(1μg/ml)刺激细胞,24小时后收集细胞上清及提取细胞总RNA及总蛋白。以ELISA法检测细胞外IL-1β的水平,同时行荧光定量PCR、westernblot检测前体IL-1β的水平,并行荧光定量PCR检测ZHC116对NALP3炎性体的主要组分NALP3、caspase-1mRNA表达的影响。结果：LPS(1μg/ml)刺激24小时后,上清的IL-1β水平明显增高,给予ZHC116(0.1mM)处理后,IL-1β水平明显降低。荧光定量PCR及前体IL-1β的western结果显示,ZHC116(0.1mM)能显著抑制IL-1β的转录。NALP3及caspase-1的荧光定量PCR结果显示,LPS刺激后,这两者的转录水平均增高,而ZHC116(0.1mM)对其有抑制作用。结论：ZHC116能降低巨噬细胞中IL-1β的表达和释放,并可能通过抑制NALP3炎性体的表达而发挥作用。
【作者】杨文君；
【导师】陶立坚；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】ZHC116；氟非尼酮；吡啶酮；炎症；纤维化；MTT；全身炎症反应综合征；内毒素血症；白介素-1；NALP3炎性体；caspase-1；

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