小胶质细胞激活在精神分裂症阴性症状发病机制中作用的动物研究

【摘要】研究目的：(1)在新生SD大鼠脑神经发育关键期,于海马内定向注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),观察脑内小胶质细胞(microglia,MI)的活化情况,进一步观察成年后大鼠出现的精神分裂症(schizophrenia,SZ)样动物行为改变,从神经发育的角度阐释MI激活在SZ阴性症状发病机制中的作用；(2)通过检测SZ样行为学指标,同时观察抗精神病药利培酮及抗炎药米诺环素对新生SD大鼠海马内定向注射LPS模型的行为学改善情况及免疫激活的影响,评价该小胶质细胞激活的SZ动物模型的可靠性。(3)在SD成年大鼠海马内定向注射粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF),评价其SZ样动物行为学改变,观察脑内MI的激活效应,分析MI激活与大鼠SZ样行为学异常的相互关系；(4)观察母孕期聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylicacid,PolyI:C)诱导的经典SZ模型其子代小鼠脑内MI的激活状态,进一步验证神经发育关键期M激活在SZ发病机制中的作用；(5)观察MI激活抑制剂米诺环素对SZ模型动物行为学的改善作用,尤其对阴性症状和认知障碍的作用,探讨其治疗机制,为米诺环素治疗SZ阴性症状和认知障碍提供动物实验证据。研究方法：(1)在SD大鼠出生后第7天(PD7)将其随机分为两组,分别在腹侧海马内立体定向注射LPS或灭菌生理盐水,然后将LPS组和灭菌生理组大鼠均各自随机分为两组,分别持续3天腹腔注射米诺环素或者生理盐水(PD7-9)。在大鼠PD60时检测其行为学,包括：旷场实验、社交行为测试、前脉冲抑制(prepulseinhibition,PPI)。在腹侧海马立体定向术后的2天、2周、2月灌流固定取脑组织,并通过免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC)用一抗Iba1、GFAP、CD68分别检测脑区(包括海马、皮层、丘脑)内MI、星形胶质细胞及巨噬细胞的表达水平。(2)在SD大鼠出生后第7天将其随机分为两组,分别在腹侧海马内立体定向注射LPS或灭菌生理盐水。从PD42开始,LPS或灭菌生理盐水大鼠各自随机分为四组,分别给予利培酮、米诺环素、利培酮联合米诺环素和生理盐水(灌胃,持续2周)。然后检测旷场实验、社交行为测试、PPI和新奇物体识别能力。再通过IHC检测海马、皮层和丘脑内MI的表达,用蛋白质印迹方法检测海马、前额叶和纹状体内白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。(3)将SD成年大鼠随机分为两组,在双侧腹侧海马内立体定向埋植微透析泵,持续2周分别泵入GM-CSF或灭菌生理盐水；同时将上述两组大鼠各自随机分为两组,分别给予2周的米诺环素或者生理盐水灌胃治疗,并检测旷场实验、社交行为测试和PPI,通过IHC检测海马、皮层和丘脑内MI的表达,并分析上述行为学异常与MI激活状态的相关性。(4)将C57BL/6母孕鼠于第9天随机分为两组,分别腹腔注射一次PolyI:C或灭菌生理盐水。将上述两组小鼠的子代在PD42时各自随机分为两组,分别给予米诺环素或者生理盐水(灌胃2周),然后检测上述行为学指标以及海马、皮层和丘脑内MI的表达情况。研究结果：(1)新生期腹侧海马定向注射LPS的SD大鼠于成年期表现明显的与SZ阴性症状和认知障碍相关的行为学异常(社交行为减少、PPI降低)；脑区(海马、皮层、丘脑)内MI大量增加及激活,这一激活状态从大鼠新生期持续到成年期。预先给予MI激活抑制剂米诺环素能够防止这些行为学的异常改变及MI的过度激活；而各组间星形胶质细胞和巨噬细胞则无数量和激活的显著改变；(2)在新生期腹侧海马定向注射LPS模型大鼠的青春期给予利培酮、米诺环素和利培酮联合米诺环素治疗,均能改善LPS模型大鼠的SZ样动物行为异常(社交行为减少、PPI降低和物体识别能力损害),并能抑制其海马、皮层、丘脑内激活的MI；此外,米诺环素、米诺环素联合利培酮能够抑制海马内IL-1β和TNF-α的表达上调,利培酮不能抑制海马内IL-1β和TNF-P的表达上调,米诺环素、利培酮、米诺环素联合利培酮能够抑制纹状体内IL-1β和TNF-α的表达上调,但各组间前额叶内IL-1β和TNF-α的表达无差异。(3)GM-CSF组大鼠表现出明显的SZ样动物行为异常,包括自发活动增加、PPI显著降低、社交行为异常；GM-CSF组大鼠脑内(海马、皮层、丘脑)MI数量显著增加及激活,且MI激活程度与SZ的某些行为学异常显著相关(自发活动量与海马和丘脑内的MI激活程度呈显著正相关,PPI值下降程度与海马内的MI激活程度呈显著负相关)；同时米诺环素治疗能够通过抑制MI的激活改善SZ模型大鼠的社交行为损害和PPI缺陷(与阴性症状和认知障碍相关的行为),而对自发活动量增加(与阳性症状相关的行为)无影响。(4)米诺环素能够改善PolyI:C模型的SZ样动物行为异常(自发活动量增加、社交行为异常、PPI值下降),并且该模型组子代小鼠脑内(海马、皮层、丘脑)也存在MI数量增加及激活,米诺环素能够一定程度的抑制这些激活的MI。研究结论：(1)在啮齿类动物的母孕期、新生期、成年期激活MI均产生SZ样行为学异常,尤其是阴性症状和认知障碍相关的行为学异常,说明MI激活可能是SZ的阴性症状发病机制之一；(2)SD新生大鼠海马立体定向注射LPS模型具备SZ动物模型的一些行为学特征(尤其是与阴性症状和认知障碍相关的行为),抗精神病药对该模型具有一定疗效,也较符合SZ的神经发育假说,作为SZ的新动物模型值得进一步研究。(3)非典型抗精神病药利培酮能够下调MI的激活及细胞因子,说明抑制MI激活及细胞因子可能是此类抗精神病药物改善SZ阴性症状及认知障碍的作用机制之一。(4)MI激活抑制剂米诺环素能够改善M异常激活模型动物的SZ样行为学异常,尤其是阴性症状和认知障碍,为米诺环素辅助治疗SZ提供了基础实验依据,且其治疗机制可能与抑制MI激活及细胞因子有关。
【作者】朱芙蓉；
【导师】赵靖平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】精神分裂症；阴性症状；小胶质细胞；啮齿动物；脂多糖；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；聚肌胞苷酸；米诺环素；

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