通过优化Kex2 P1’位点在毕赤酵母中高效表达重组蛋白SCF

【摘要】如今，重组蛋白的研究已经日趋成熟，各种蛋白表达体系也被不断完善，其中巴斯德毕赤酵母作为经典蛋白表达系统被广泛应用。毕赤酵母具有生长速率高，培养条件简单，毒性小，污染少，分泌出蛋白构象完整，活性高等优点，但其蛋白分泌水平不稳定也成为生产和科研的一大难题。本文针对酵母分泌不稳定的问题，优化了毕赤酵母Kex2P1’位点氨基酸，从而使Kex2切割信号肽的效率明显提高，大量增加毕赤酵母分泌蛋白量。为了利于筛选出高表达的突变株，本研究将报告基因Luciferase整合到表达载体pPICZαA中，使其与目的基因融合，在适宜的条件下共同表达，从而通过Luciferase报告基因的表达情况，间接标定目的蛋白的表达情况。荧光素酶在ATP，Mg2+，O2存在的下，与特异的荧光素酶底物反应，释放出光子，从而可以通过荧光照度计对荧光值进行定量的检测。由于报告基因Luciferase与目的基因属于融合表达，通过荧光值的高低筛选出高表达的突变株，用于后续的目的基因表达及纯化。本研究在优化毕赤酵母Kex2P1’位点的基础上，对干细胞因子SCF进行了大量表达及纯化。SCF作为重要的造血干细胞因子，其功能作用主要是通过与e-kit受体相结合，刺激肥大细胞的增殖，协调其他生长因子维持祖细胞、造血细胞存活，对细胞数量集落的增加、定向分化以及粘附起着重要的作用。本文以pPICZα-A作为载体，通过分子克隆手段对pPICZα-A进行改造，优化Kex2P1’位点氨基酸，使SCF大量表达，并通过多步纯化，最后得到活性较高的SCF。
【作者】匡野；
【导师】宿晓云；吴东海；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】毕赤酵母；Kex2；P1’位点；SCF；表达与纯化；

【参考文献】
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