p38γ在人脑星形细胞瘤中的表达及生物学意义的研究

p38γ在人脑星形细胞瘤中的表达及生物学意义的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-18 分类:毕业论文 喜欢:690
师大云端图书馆

【摘要】背景:作为最常见的神经上皮性肿瘤,星形细胞瘤通常具有无限增殖和侵袭性生长的特点,尽管目前已有多种治疗手段,但该病的整体预后仍欠佳,因而仍有必要深入研究其肿瘤发生发展的分子机制以寻找新的有效治疗靶点。p38γ是p38MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)的四个亚型之一,正常情况下仅表达于骨骼肌组织。近年来的一些研究发现p38γ可能参与一些潜在的细胞恶性转化的调节过程,表明其在肿瘤的发生和进展过程中潜在的致瘤性,但具体作用机制仍然不明。目前国内外尚未有研究揭示p38γ在人脑星形细胞瘤组织中的表达情况及其对肿瘤生物学行为的影响。目的:探讨p38γ在人脑星形细胞瘤组织中的表达情况及与各项临床病理指标的关系。构建沉默人p38γ基因表达的siRNA序列并筛选出有效siRNA序列,为后续体外实验研究p38γ的生物学功能提供基础。探讨p38γ对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等多种生物学特性的影响及相关的作用机制。方法:标准化采集61例人星形细胞瘤和5例非肿瘤性脑组织标本,分别用Westernblot及免疫组化法检测前述标本中p38γ和hTERT蛋白的表达差异,分析p38γ表达水平与星形细胞瘤患者各项临床病理指标的关系。设计针对p38γ的siRNA片段(3对),借助LipofectamineTM2000转染入人胶质瘤U251细胞,使用荧光定量Realtime-PCR及Westernblot评价沉默效率,筛选出最有效的干扰序列用于后续实验。运用CCK-8、流式细胞术、Transwell实验等技术观察siRNA沉默p38γ后U251细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的变化。同时为研究前述变化的具体作用机制,检测hTERT、MMP-2及MMP-9蛋白含量(westernblot),端粒酶活性(TRAP-PCR银染法),Caspase-3/-9酶活性(分光光度法)及细胞骨架形态(免疫荧光染色)。结果:1.与非肿瘤性脑组织相比,星形细胞瘤中p38γ蛋白的表达明显升高,且在高级别星形细胞瘤中表达量高于低级别星形细胞瘤(P<0.05)。hTERT蛋白的表达规律亦如此,且与p38γ蛋白的表达水平呈正相关(P<0.01)。但p38γ表达水平与患者年龄、性别及肿瘤直径不相关(P>0.05)。2.Realtime-PCR和westernblot分析显示,三组p38γ-siRNA干扰序列转染U251细胞后,p38ymRNA和蛋白表达均受到抑制(P<0.05)。其中siRNA-3片段(针对1168位点)沉默效率最高,与空白及阴性干预对照组相比,其p38γmRNA抑制率达(92.7±1.12)%,p38y蛋白表达下降达(62.2±1.29)%(P<0.01)。3.U251细胞转染p38y/siRNA后,其细胞增殖率为(47.0±2.3)%凋亡率为(11.97±0.41)%,与空白及阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。siRNA沉默p38γ基因的U251细胞中hTERT蛋白表达受到明显抑制,端粒酶活性显著下降,Caspase-3/-9酶活性显著上升,与另外两组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。4.U251细胞转染p38y/siRNA后,迁移穿膜细胞数为44.0±1.0,侵袭穿膜细胞数为30.6±0.9,与空白及阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光显微镜下可见,抑制p38γ表达的U251细胞中肌动蛋白细胞骨架明显紊乱,稀疏,成束性结构减少。侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白的表达相比另外两组均下降(P<0.01)。结论:1.p38γ蛋白在人脑星形细胞瘤中异常高表达,且其表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关。2.U251细胞中的p38γ因siRNA干扰而下调后,可能经由抑制hTERT表达进而降低端粒酶活性,从而起到抑制U251细胞增殖,促进其凋亡的作用。3.U251细胞中的p38γ被siRNA沉默后,可能通过紊乱肌动蛋白细胞骨架结构,下调侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达来降低U251细胞的迁移侵袭能力。4.p38γ在人脑星形细胞瘤中扮演瘤基因的角色,可能是潜在的胶质瘤诊断和治疗靶点。
【作者】杨魁;
【导师】刘运生;
【作者基本信息】中南大学,临床医学,2013,博士
【关键词】星形细胞瘤;p38γ;人端粒酶逆转录酶;U251;小干扰RNA;

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