非典型趋化因子受体CCRL1对肝细胞癌生物学特性的影响

【摘要】肝细胞肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,我国是肝癌的高发国家,约占全球肝癌病例一半以上。虽然肝癌研究已取得很大进展,但由于肝癌的疾病过程进展迅速、具有极高的复发转移倾向,致使肝癌总体疗效仍然不佳。目前,肝肿瘤切除术和肝移植仍然是治疗肝细胞肝癌的最有效的标准方案,术后5年内仍有50%-70%复发率。因此探索肝癌转移复发的机制,了解肿瘤的侵袭转移能力,预测患者预后,寻找有效的抑制途径,并在复发高危人群中进行防治成为进一步提高肝癌生存率的关键。肿瘤的发生发展、侵袭转移是一个多步骤的复杂动态过程。只有从微环境与肝癌相互作用的角度进行了综合研究,才能全面、深刻认识肝癌发生发展和转移复发的内在机制。在这一过程中有多种因素如细胞因子、生长因子、细胞粘附分子、细胞外蛋白酶和血管生成因子等参与。越来越多的研究表明趋化因子及其受体与肿瘤的发生发展密切相关,特别是在肿瘤的细胞生长、迁徙转移、血管形成以及免疫细胞在肿瘤的浸润方面可能起到关键的作用。本研究主要探讨非典型的趋化因子受体CCRL1对肝细胞癌生物学特性的影响。利用组织芯片技术对240例原发性肝癌手术切除的患者进行分析,发现在肝癌组织中CCRL1的表达明显降低,并且低表达组的患者预后要明显差于高表达组。随后通过慢病毒转染技术,调控CCRL1在肝癌细胞系的表达,通过一系列体外和体内实验,研究CCRL1的表达对肝癌细胞生长增殖、侵袭转移方面的影响,最后探讨CCRL1抗肿瘤效应的可能机制,为防治肝癌提供新的可能靶点。第一部分CCRL1在肝癌组织中的表达及其临床意义研究本研究旨在探索CCRL1在癌、癌旁组织以及肝癌细胞系中的表达情况,以及表达水平与患者预后的相关性首先对240例原发性肝癌手术切除的患者的癌和癌旁组织进行CCRL1的免疫组化染色,并通过Image-ProPlus6.0软件(IPP,MediaCybernetics)对染色照片进行平均光密度的测定。然后运用Real-timeRT-PCR和Westernblot技术在6种肝癌细胞系中检测CCRL1的表达情况。最后将患者CCRL1的染色情况与相关临床资料进行了综合分析,判断CCRL1作为患者预后指标的价值。本研究显示,CCRL1在癌组织中的表达要明显低于癌旁组织(P=0.015),可见在癌组织中存在CCRL1的缺失。对细胞系的检测中发现,CCRL1在不同的肝癌细胞系中存在表达差异,特别是在MHCC97H(97H),MHCC97L(97L)和MHCCM3(M3)这三株细胞胞系中,随着细胞侵袭转移能力的提高(97L<97H<M3),CCRL1的表达同步降低(97L>97H>M3),这提示CCRL1可能具有抑制肿瘤侵袭转移的潜能。240例患者的临床及随访资料显示,CCRL1的低表达与肝癌的血管侵犯(P=0.038)和肿瘤低分化(P=0.037)显著相关。低表达CCRL1的患者,其总生存率(P<0.001)和无瘤生存率(P=0.002)要显著低于高表达组。Cox回归多因素分析显示,CCRL1与肿瘤数目、血管侵犯一样,是评价患者总生存(hazardratio,HR=0.579；95%confidenceinterval,CI=0.411-0.816；P=0.002)和无瘤生存(HR=0.657；95%CI=0.462-0.934；P=0.019)的独立危险因素。以上结果表明,低表达CCRL1的肝癌细胞恶性程度高,患者的预后差。对CCRL1表达量的检测有助于对肝癌术后复发的预测以及高危病例的预防性治疗。第二部分调节CCRL1表达对肝癌细胞生物学特性的影响本研究旨在通过建立细胞及动物模型,探索CCRL1在体外以及体内实验中对肿瘤细胞生长、迁移、侵袭以及转移等生物学行为的影响。利用慢病毒载体在97L和M3细胞系中分别转染shCCRL1敲除质粒和CCRL1过表达质粒,从而构建97L-shCCRL1和M3-CCRL1稳定细胞系。随后借助Cell-IQ系统检测转染前后的增殖能力的变化；划痕实验检测迁移能力的变化；Transwell小室实验检测细胞侵袭能力的改变。进一步通过建立裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型,研究转染前后细胞成瘤能力和肺转移情况。同时通过ELISA检测了细胞上清和小鼠原位成瘤瘤体内的CCL19和CCL21的含量。结果显示,体外实验中下调CCRL1的表达后,肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力都明显提高,而且上清CCL19和CCL21的量也显著上升。反之,过表达CCRL1后,增殖、迁移、侵袭能力和CCL19和CCL2l的量均下降。体内实验中,低表达组成瘤的大小显著高于高表达组(P<0.05),且具有更多的肺转移(P<0.05)。体内外实验表明,CCRL1能够抑制肝癌细胞增殖,降低迁移和侵袭能力,并提示CCRL1可能成为肝癌治疗的新靶点。第三部分CCRL1对肝细胞癌生物学特性影响机制的研究为了探讨CCRL1抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的内在机制,本研究从肿瘤细胞本身和对微环境的改变两方面入手。一方面,CCRL1通过降低其配体(CCL19,CCL21)的浓度,从而影响肿瘤细胞上这些配体另外的受体(CCR7)的功能,进而发挥抗肿瘤的作用。另一方面,CCRL1高表达后也能引起一些趋化因子的上调,而这些趋化因子与一些淋巴细胞的募集有关,本实验主要集中在对肿瘤浸润的B淋巴细胞的研究。首先对HCC患者肝癌组织的连续切片进行了免疫组化染色,指标包括CCRL1,CCL19,CCL21和CCR7。借助westernblot技术,在已建立的细胞系97L-shCCRL1对多条信号通路的分子进行了检测,并运用siRNA技术下调了CCR7后检测了肿瘤细胞增殖和侵袭能力以及信号通路的变化。另一方面,通过不连续梯度离心将浸润组织的CD20+B淋巴细胞分出,运用细胞流式和免疫荧光技术对其表型和产生的细胞因子进行鉴定,并通过和肿瘤细胞共培养,研究其对肿瘤细胞的直接作用。免疫组化结果显示,CCRL1的表达与CCL19、CCL21和CCR7存在呈显著负相关。Westernblot结果显示CCRL1下调后,Akt/GSK-3p的磷酸化程度明显上升,提示CCRL1可能通过该信号通路对肿瘤细胞的增殖侵袭进行调控,而这一过程受到肿瘤自身CCR7的影响。浸润组织的B淋巴细胞主要集中在肿瘤交界区,交界区中的B细胞表现为IgD-IgG+CD27-CD38-的表型,能够产生IFN-γ和IL-12,同时还能够通过granzymeB和TRAIL对肿瘤进行直接杀伤,并且其密度还与患者的预后相关。综合以上结果,我们认为高表达肿瘤细胞的CCRL1,能够降低CCL19和CCL21的量从而通过抑制肿瘤细胞的CCR7/Akt/GSK-3p通路影响肿瘤的存活能力,同时还能吸引CD20+B细胞对肿瘤进行杀伤。
【作者】施杰毅；
【导师】樊嘉；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】原发性肝癌；非典型趋化因子受体；CCRL1；CCR7；CD20；预后；

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