SNAP-25对神经病理性疼痛兴奋抑制失衡作用机制的研究

【摘要】研究背景神经病理性疼痛由中枢或者外周躯体感觉神经系统的损伤或疾病而导致的疼痛。中枢神经系统中,疼痛信号的传递通过递质的释放和清除完成,这一过程连续而精确。其中递质释放主要依赖于形成SNARE复合物,而递质清除则通过一系列特异性的递质转运体完成(如兴奋性递质谷氨酸转运体GT和抑制性递质GABA转运体GAT-1)。神经病理性疼痛中存在兴奋性递质过度激活和抑制性递质缺失的现象,称之为兴奋抑制失衡。SNAP-25是SNARE复合物三种蛋白之一,因此能调节递质释放。GLT则是清除中枢神经系统突触间隙中谷氨酸最重要的两种谷氨酸转运体之一。SNAP-25在神经病理性疼痛中对递质释放的作用,及其对GLT和GAT介导递质清除的影响,尚待研究。目的构建大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(chronicconstrictioninjury,CCI)模型,鞘内注射A型肉毒素降低SNAP-25的表达,动态观察大鼠疼痛行为学的变化与SNAP-25表达水平的关系,检测兴奋性谷氨酸转运体GLT及抑制性GABA递质转运体GAT的变化,探讨探索SNAP-25对兴奋性和抑制性递质释放和后续清除的调控机制,了解其对神经病理性疼痛的治疗机制。方法1.腰段鞘内置管成功的雄性SD成年大鼠随机分为3组：假手术+生理盐水组(sham+NS组)、CCI+生理盐水组(CCI+NS组)、CCI+BoNT/A0.01U组(CCI+BoNT/A组)。CCI组按照Bennett和Xie的方法建立大鼠左侧坐骨神经慢性压迫性损伤模型,假手术组仅暴露左侧坐骨神经不结扎,术前及术后3、5、7、10、14天进行机械痛阈、热痛阈检测。术后14天测试后于深麻醉下处死取脊髓腰膨大段行Western-blot以及RT-PCR测定。2.所有大鼠术后14天测试后于深麻醉下处死取脊髓腰膨大段行GLT的逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)检测兴奋性谷氨酸递质转运体GLT和离子型谷氨酸受体NMDA中NR2B亚基的表达变化。3.大鼠术后14天测试完毕后于深麻醉下处死,取脊髓腰膨大段采用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)和蛋白印迹(westernblot)方法检测抑制性GABA递质转运体GAT的表达变化。结果1.术前两组大鼠机械痛阈和热痛阈无明显差别(P>0.05),术后第3天,相对于sham组,CCI组机械痛阈和热痛阈明显下降(P<0.05),并于术后第7天降至最低点(P<0.05),下降持续至第14天。鞘内单次注射A型肉毒素0.01u后能明显缓解CCI大鼠的疼痛,CCI+BoNT/A组给药后第2天／术后第5天,机械痛阈和热痛阈较CCI+NS组明显升高并持续至第14天。术后14天RT-PCR和Westernblot检测大鼠脊髓腰膨大处SNAP-25的mRNA和蛋白水平,CCI+NS组比Sham组SNAP-25的表达均明显升高(P<0.05),鞘内注射A型肉毒素后,CCI+BoNT/A组表达明显降低(P<0.05)。2.术后14天RT-PCR检测大鼠脊髓腰膨大处GLT和NR2B的mRNA表达水平,CCI+NS组比Sham组GLT水平明显降低(P<0.05),而NR2B表达明显升高(P<0.05)；鞘内注射A型肉毒素后,CCI+BoNT/A组GLT表达水平上升(P<0.05)而NR2B表达水平下降(P<0.05)。3.术后14天RT-PCR和Westernblot检测大鼠脊髓腰膨大处GAT-1的mRNA和蛋白水平,CCI+NS组比Sham组GAT-1的表达均明显升高(P<0.05),鞘内注射A型肉毒素后,CCI+BoNT/A组表达无明显变化(P>0.05)。脊髓腰膨大处免疫组化显示GAT-1在全脊髓中均有表达,其中灰质表达为主,在脊髓背角浅层致密表达。CCI组脊髓背角浅层处GAT-1较sham组表达明显增多。经肉毒素处理后表达未见明显改变。结论1.神经病理性疼痛大鼠脊髓SNAP-25表达明显增加,其表达水平的变化与大鼠的疼痛学行为变化相平行。提示SNAP-25可能参与了神经病理性疼痛的发生和发展。2.神经病理性疼痛大鼠脊髓GLT表达减少和NR2B表达增多,提示兴奋性递质转运体表达降低,导致兴奋性递质在突触间隙的累积,过度激活NMDA受体,是神经病理性疼痛形成原因之一。SNAP-25被A型肉毒素BoNT/A分解后能逆转此过程。3.神经病理性疼痛大鼠脊髓GAT-1表达增加,提示抑制性递质的缺失,是神经病理性疼痛形成原因之一。SNAP-25的表达水平无法影响GAT-1。
【作者】刘畅；
【导师】郭曲练；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】A型肉毒素；神经病理性疼痛；GLT；GAT-1；SNAP-25；兴奋抑制递质失衡；

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